在线引物设计primer-如何利用Primer6.0进行引物的设计？

你设计的引物是否有用?在做实验之前可以做一个电子PCR

qPCR引物设计+在线验证

方法一:NCBI上-probe

1.之前NCBI上有一个probe选项可以直接设计引物,上面会给出上下游序列。比如搜索小鼠nanog基因,它给出了这样的两条引物:

上游引物:TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT

下游引物:ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT

方法二:Primer3web

参考:Primer3web在线引物设计--2分钟学会步骤极简的引物设计!-哔哩哔哩()

2.1.寻找基因序列

以humanp53为例进行引物设计。

PubMed官网:

第一步:下拉条目选择核苷酸(Nucleotide)

第二步:输入基因+物种+mRNA(例如:p53humanmRNA)

第三步:点击搜索(Search)

第四步:单击选择左边栏的(mRNA4.782)

第五步:单击进入第一条(Homosapiens_mRNA_for_P53,completecds)为我们所寻找的p53humanmRNA

第六步:单击选择Features中的CDS选项

第七步:单击选择FASTA格式就会出现这个基因的CDS系列

2.2.开始设计引物

Primer3web官网:

/

进入Primer3web官网后,执行以下操作:

第一步:下拉条目选择物种(HUMAN)

第二步:在输入框中输入刚刚复制来的CDS序列

第三步:单击获取引物(PickPrimers)

第四步:引物序列输出;在最终结果中,有四对引物供选择。

选择合适的引物:怎样算合适?

首先看看引物的就是扩增长度,100~300bp间比较好扩增;

引物长度在20~25bp较好,而且上下游引物间不要相差超过5bp;

再就是看看Tm值,60℃左右,相差不要超过1℃。

再加一点:

既然是设计qPCR引物,那么一定要跨外显子设计,这样可以避免基因组DNA的影响CT值,如果没有跨越外显子,则扩增出来的溶解曲线CT值就会偏小。那么怎样知道自己设计出来的引物有没有跨外显子设计呢?

答案是可以根据自己设计的引物所在的基因组位置去和NCBI上该基因的外显子和内含子的连接位置进行对比。直接看那个基因的mRNA的join位置即可。

方法三:NCBI-BLAST-primer-blast

以上引物设计完成后还要自己手动去查找引物是否跨越了内含子,太麻烦了。那么再普及更方便的办法。

参考:

3.1:在NCBI上找到目的基因的mRNA序列

打开NCBI主页面,选GENE,输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因-》找到你要的种属,打开-》显示基因信息,找到“mRNAandprotein”前面那个NM***********,号码复制下来。

注意:这个时候会看到有很多条NM****信息,表示这个基因不同的isoform,通过查找文献以及这些基因序列后面的解释来确定。如果不清楚,一般选择最长的那条。

3.2:开始设计跨越外显子的引物

打开NCBI上-BLAST-primer-blast网站,将上面复制的mRNA编号输入序列框中,下拉选项中选择你的物种,然后在Exonjunctionspan下拉框选择Primermustspananexon-exonjunction,设置引物长度最小和最大值,然后点击Getprimer。就可以跳到Primer-BLASTResults页面。这个过程会有点长,稍微等一下。出来后,里面有个Graphicalviewofprimerpairs那一栏,会告诉设计出来的几对引物分别跨越了哪几个外显子。

在这些跨越外显子的引物对中选择最好的那对:

a).一对引物中只要有一个引物跨越了外显子就可以了。(因为一个引物跨了内含子,这条引物就不会和基因组DNA匹配,就算另外一个引物和基因组DNA匹配了,一条引物是扩不出来东西的。因为一条引物扩增达不到指数增长,扩了几十个循环后,信号就被指数增长的正确匹配的信号给掩盖了。就像在普通PCR中,只加上游或者下游引物,PCR出来绝对是没有东西的。因为产量太低了。)

b).一对引物之间的距离不要太长,因为扩增产物要求在100-300bp之间比较好,过长会影响CT值变小。

验证自己设计的引物PCR出来什么东西呢?可以做一个电子PCR看看。

1.UCSC-Tools-In-SilicoPCR

进入UCSC,选择Tools的In-SilicoPCR,输入上下游引物,target选择genomeassembly,点击submit,或者如果这样出不来,记得勾选FlipReversePrimer。因为可能上下游弄反了。提交后顺利的话,会出来一大段序列,上面会告诉你这个电子PCR做完后产出的序列在染色体上的位置及起止长度.然后再NCBI的gene选项输入自己PCR的目的基因,看看目的基因的起始位置,就知道这个PCR出来的是不是目的基因序列了。

注意:OCR产出的序列只可能是目的基因的一部分,对比一下序列起始位置就知道了。因为设计引物时是用目的基因设计的,PCR出来的是两条引物之间的序列。

进入NCBI-BLAST-primerBLAST;或者直接进入这个网址:Primerdesigningtool()

在primerparameter输入你刚刚设计的上下游引物

在database下拉选项选择RefseqmRNA

再点击Getprimer;

等一会,会卡一会才出来。

出来了一个Detailedprimerreports;上面写了Productsontargettemplate都是Homosapienstumorproteinp53(TP53)的不同转录本,且出来的产物长度也一样。说明这对引物扩增出来的就是这个基因。

两种验证方法优缺点:

UCSC验证方法可以检验你扩增出来的所有序列;

而NCBI的BLAST只能给出扩增出来的东西是不是你要的基因,以及扩增出来的产物的长度。

选择:建议使用NCBI-BLAST-primer-blast方法设计引物,也用NCBI-BLAST-primer-blast方法验证你设计出来的引物。

【技术分享】qPCR引物设计有妙招-知乎()

例如:Syt4(mouse)这个基因设计qPCR引物

step1:进入NCBI-GENE,找到这个基因的mRNA的NM*****号

step2:将这个号输入NCBI-BLAST-primer-blast输入序列框中,勾选相应条件;,且限制了PCR产物长度在70-300之间;由此设计出了10条跨内含子的引物,由Tm条件等选出了第二对引物:

上游:GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT

下游:CCAACCGTCCAATCACCTCA

step3:将这对引物重新输入NCBI-BLAST-primer-blast的上下游引物框中,点击Getprimers,发现这对引物扩增出来的基因就只有Syt4基因,说明这对引物特异性很好。

step4:进入UCSC-Tools--In-SilicoPCR,输入上下游引物,点击提交,即可。如果跳转出来没有产物,则重新返回调整一下参数,比如说target参数,FlipReversePrimer:是否勾选等。最终产物是Syt4,长度220bp。说明这对引物的PCR产物特异性很高,只有这一个产物。

step5:进一步验证:由于设计引物时跨越了内含子,且已经提醒我是上游引物跨越了内含子,于是我进入NCBI-Nucleotide输入:Syt4MusmusculusmRNA,点击搜索,然后点击左边栏目中的mRNA,然后点击第一条........参考以上2.1步骤,寻找这个基因的CDS序列,找到CDS序列后,搜索这两条上下游引物,发现在CDS区域中,且这对引物的PCR产物序列也在CDS区域中,仔细查看发现上游引物所在位置是1203-1224,确实跨越了两个外显子:exon1098..1218和exon1219..3901.

以上我们设计出了Syt4这个基因的qPCR引物序列。可以直接让公司合成了。

以上所讲的都是qPCR的引物设计,一般扩增出来的基因产物都只有100-300bp之间,用于定量或者半定量。但是如果想要扩增全长DNA,则用到Primer5软件。扩增产物的长度可以自己在上面设置。

如何使用PrimerPremier5软件设计PCR引物-百度经验()

首先是看你设计的引物是干什么用的如果是用来做普通PCR检测或者RealtimePCR的话把mRNA序列拷贝进去选择相应大小原则上讲普通PCR产物大小在250~600bpRealtimePCR的产物大小控制在100到200之间最好最大不超过250系统给出的引物对进行BLAST分析选择跨外显子引物对

不需要太关心引物设计经典规则比如末端不能有什么碱基GC%是多少Primer3自己的设计算法非常好及时设计出的引物有二聚体发卡结构等绝大多数情况都不影响使用甚至是非常好用

如果是扩则固定序列的话基本不需要使用Primer3看一下GC%比较平均没有连续重复序列的就可以了这部分是另说

如何利用Primer6.0进行引物的设计？

1.首先,选取目的基因序列,对格式没有什么要求,只需要将目的基因序列复制就可以。

2.打开File目录下的New,选择Sequence。这里的另一个Project选项是导入文件的方式,也就是将目的基因以文件形式保存的可以直接导入文件。一般通过复制的方式会更方便。

3.打开Sequence后,会弹出粘贴框,只需要将刚刚复制的基因序列粘贴上即可,然后点击下方的Add。

4.选择上方的红蓝双向箭头的按钮进行引物设计,在设计开始前可以更改设计的参数,包括搜索的碱基范围、引物的长度,碱基数,设计结果显示的引物对数等。

5.设置完参数后,点击下方的Search,软件开始分析设计,完成后,点击OK。设计结果就会在下面显示出来。

6.结果中蓝色为前引物,红色为后引物,Rating是对引物的综合评价分数,在上方也会显示引物的优劣,最好的为Best,中等为Good,最次的为Poor。一般选择引物都为Best或Good,其它显示均是无法使用的。

7.在右边还有两个选项,AllPrimers可以查看可选择的多对不同引物。可以根据需要选择合适位置和适当产物长度的引物。选择后需要点击下方的Replace才能替换。

8.AllStructers则可以查看当前选定引物的结构,如发夹结构,引物二聚体和重复碱基等。

9.引物选定完成后,点击下方的引物序列,再右键会弹出复制信息选项,进而将设计好的引物导出。也可以直接以文件的形式将结果导出。

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