内含肽的分离纯化

内含肽具自切割特性的这种特性而实现目标蛋白与亲和标签分离的目的。内含肽在蛋白质纯化中的应用修饰后(位点特异性突变)的内含肽经诱导能够介导N端或C端单侧肽键断裂。首先将编码亲和标签、内含肽及目标蛋白的基因序列连接在一起，在合适的宿主系统中表达出一个标签-内含肽-目标蛋白的三联体，利用修饰后的内含肽构建的蛋白纯化载体可以将目的蛋白直接融合表达于内含肽的N端或C端，几丁质结合域(chitin binding domain，CBD，5kDa，环状芽孢杆菌)融合表达于内含肽的另一端或内部。当这个“三元”融合蛋白复合物流经结合有几丁质的亲和纯化柱时，再利用固定在树脂上的配体吸附三联体的标签而截留融合蛋白，随后在某些简单的理化因素作用下(如pH、温度的变化或者巯基化合物的加入)该三联体从内含肽的N一端或者C端端发生白切割释放目标蛋白，而此内含肽与CBD的复合物结合在亲和纯化柱上，目的蛋白直接洗脱下来。
传统的亲和纯化方式是指利用基因融合技术将亲和标签和目标蛋白进行融合表达质，再依靠亲和标签与固定化的配体之间的特异性吸附作用实现目标蛋白的分离纯化。通常情况下，通过亲和层析得到的融合蛋白，需再经过蛋白酶的水解用移除亲和标签以得到纯化的目标蛋白质。在实验室规模的应用中，亲和纯化方式有着简单而方便的优点，但也存在着一些缺陷。一方面，为了消除亲和标签常常需要外加蛋白酶。尽管设计之初在融合标签与目的蛋白质之间引入了能够被蛋白酶特异性识别并切割的连接片段， 但仍然存在着目标蛋白质被意外切割的情况：再者，后期对蛋白酶的清除过程以及蛋白酶本身较高的价格也增加了蛋白质纯化的成本。另一方面，亲和树脂及缓冲液的高制造成本也进一步加大了蛋白质纯化的代价， 而在火规模的生产应用中， 成本因素往往是必须考虑的一个重要方面。
以内含肽为基础的蛋白纯化技术的优越性在于：不需要使用昂贵的蛋白酶进行蛋白裂解；裂解仅发生在剪接位点，与目的蛋白上的蛋白酶敏感位点无关，避免了蛋白酶对目的蛋白的降解；蛋白纯化和内含肽活性的诱导均可直接在亲和纯化柱上进行；最为重要的是，内含肽介导的蛋白质纯化不会对蛋白质的生物学活性产生影响
内含肽介导的蛋白连接(intein—mediated protein ligation,IPL)。
通过改变裂解条件以及对内含肽进行适当修饰，可以生物合成c端带有硫酯键或N端带有半光氨酸的蛋白质分子。两种蛋白质混合以后，硫酯键和半光氨酸利用“自然化学连接”(native chemical ligation)的原理进行自发的连接反应，在硫酯和半光氨酸之间形成肽键，从而将两种蛋白质连接起来。自然化学连接是从蛋白质半合成研究中发展起来的技术 ，其基本原理是，C端带有硫酯的合成肽与N端带有半光氨酸的合成肽或蛋白质混合后，硫酯和半光氨酸之间会发生高效的化学选择性反应，形成的硫酯键将两个蛋白质分子连接起来，随后的S- N的酰基重排将硫酯键转变为肽整个过程除了没有发生Asn的环化以外，与内含肽的作用机理基本一致。但是，自然化学连接法不能在细胞中表达C末端硫酯蛋白，而且固相合成的肽链长度也有限
断裂型内合肽介导的蛋白质环化
环化蛋白质具有3个明显的特性：①提高稳定性和活性，这是由于环化的蛋白质可以减少非折叠状态的构象熵值；②折叠速度快，这是因为其减少了折叠途径的数目的缘故；③对N端和C端特异性的蛋白酶具有抗性，因此能改善在体内的稳定性。由于以上特性，环化蛋白质在蛋白质工程和医药工业中备受重视。以IMPACT～TWIN(NEB公司产品)和SICLOPPS为代表的2种载体分别被构建，用于体外和体内环化蛋白。IMPACT一rWIN用于表达“N端内含肽一靶蛋白一C端内含肽”形式的融合蛋白。在体外纯化后，经pH及巯基诱导切割此产物产生N端的半胱氨酸和C端的巯酯键，在低浓度下有利于靶蛋白分子内末端连接反应形成环状分子，而在高浓度下则促进分子之间末端的连接，从而产生串联的多聚产物，然后通过内含肽介导的连接方式(intein—mediatedproteinligation，IPL)由N端半胱氨酸攻击C端巯酯键。天然存在的SspDnaE断裂型内含肽两端片段具有很强的亲和性，靶蛋白基因被插入C端和N端之间形成一个三明治结构，经剪接后靶蛋白的N端和C端在体内通过正常的肽键连接而产生环化产物。相对于体外环化系统来说，目的蛋白在体内不须化学处理在细胞内进行自我环化反应，因此具有广泛的应用价值。通过控制温度表达DnaE内含肽也可以在体外环化蛋白，以便纯化产物。除了SspDnaE以外，PI—PfuI和RecA内含肽也得到成功应用
内含肽剪接调控以作为药物“开关”
含肽作为药物靶标的研究于内含肽这种可调控的作用机制，Bonnanl51为，通过改变剪接结构域上、下游的序列，自主设蛋白质内含肽，可以调控蛋白质的剪接。因为包含内含肽的前体蛋白无活性的，所以那些能阻断剪接的化学物质将具有重要的药用价值。由于目前在动物和人体正常新陈代谢中没有发现内含肽的报道，作为药靶标的内含肽将不大可能有毒副作用。
内含肽可作为抗结核分支杆菌药物靶标
由于肺结核的复发率高，且病菌对抗生素耐药具有适应性，针对结核分支杆菌(Mycobacteriumtuerculosis)的快速而独特的诊断工具就显得非常需要。分支杆菌是通过内含肽的作用影响人类的相关病，如结核、麻风病。在肺结核的发生中，DNA编码RecA和DnaB这两个蛋白质起重要作用，RecA和DnaB均需通过内含肽的剪接才能成为致病的功能蛋白。应用突变试剂或生长抑制剂，干涉蛋白质剪接，RecA和DnaB将失去致病的功能。对结核分杆菌来说，镶嵌有内含肽的蛋白质RecA和DnaB一定条件下将是有毒的，它们能引起结核分支杆生长抑制和死亡。如果通过某些潜在抑制剂的研发，直接调控RecA和DnaB的剪接过程。该抑制剂是针对受染组织或致病菌的DecA和DnaB的剪接过程，抑制致病毒蛋白的成熟，从使结核分支杆菌丧失致病功能，这样内含肽可成抗结核分支杆菌的药物靶标。另外，由于RecA、DnaB的内含肽在结构上非常接近，如果用多种制剂的组合同时作用于RecA和DnaB的内含肽剪接过程，将比单独调控RecA或DnaB的内含肽剪作用更有效。
内含肽可作为治疗线粒体疾病药物靶标
粒体DNA(mtDNA)突变，将导致mtDNA编码、与氧化磷酸化有关的13种蛋白质的突变，从而起很多罕见的疾病，这也可能是人类衰老的原因之一。由于该13种蛋白质高度的疏水性，通过转基编码表达的有生物活性的蛋白质很难从细胞质中进入线粒体。根据内含肽的作用机制，首先在胞质合成线粒体目标蛋白前体片段序列，该序列无生物活性，但包含引导序列和内含肽相应的c端或N剪接结构域的保守氨基酸残基，当序列进入线粒后，引导序列被降解，c端与N端的特异氨基酸通转酯作用，形成包含内含肽序列的前体蛋白质，最后通过内含肽介导的剪接作用，在线粒体基质中形有活性的蛋白质，从而达到治疗线粒体疾病的作用。
蛋白剪接作为一种发生在翻译水平而非转录水平的生物大分子成熟形式，进一步增加了蛋白质生物合成机制的复杂性。
事实上，人们还不清楚内含肽存在的真正的生物学意义。但有理由相信，随着内含肽研究的深入，内含肽相关技术的应用会得到更广的重视和发展。