如何验证一段在哺乳动物不存在的序列

如何验证一段在哺乳动物不存在的序列
有SV40病毒表达载体、痘病毒表达载体、逆转录病毒表达载体，常见的哺乳动物表达载体的组成成分有：原核DNA序列、启动子、增强子、拼接 信号、终止信号和多聚腺苷酸化信号、筛选标记及真核病毒序列等。
(1)原核DNA序列： 为了能在大肠杆菌中增殖，得到大量能转染哺乳动物细胞的重组DNA，不哺乳动物表达载体中通常有一段原核序列，包括一个能在大肠杆菌中自身复制的复制子， 便于挑选含重组DNA细菌的抗生素抗性基因，以及便于把真核序列插入载体的少数单一限制性酶切位点。当具 备这些序列以后，外源的真核基因序列可由单一酶切位点插入载体中，形成的重组DNA可在大肠杆菌中增殖，经抗生素筛选后进行DNA提取，即可得到大量的所需的哺乳动物细胞表达载体。
(2)启动子： 真核生物的启动子区域位于TATA区上游100bpd到230bp之间，TAT区位于转录起始点上游25-30bp处。启动 子的转录销路因细胞而异。因此需根据宿主细胞类型选择不同的启动子。
(3)增强子： 增强子是使启动子的基因转录效率显著提高的一类顺式作用元件，有多个独立核苷酸序列组成。它们的作用通常不具有方向性，在位于转录起始点的下游或离启动子很远是仍有活性。许多增强子只 能在特定的组织或细胞中起作用，即具有组织细胞的特异性，因此在构建真核表达载体的时候，应根据宿主细胞来选择增强子。
(4)剪接信号： 真核基因由许多内含子和外显子组成。被转录成mRNA前体以后，需通过剪除内含子、连接外显子才能成为成熟的mRNA。一 般mRNA拼接需要的基本序列位于内含子的5’和3’末端，因此，改变拼接位点5’和3’末端两侧的外显子序列可能回影响邻近拼接位点的使用效率，在替换 外显子是应注意。
(5)终止信号和多聚腺苷化的信号： 转录的终止信号常常位于多聚腺苷化位点下游的一端长度为几百个核苷酸碱基的DNA区域内。多聚腺苷化需要两种序列：位于腺苷化位点下游的GU丰富区或U丰富区和 位于腺苷化位点上游11-30个核苷酸处的一个有6个核苷酸碱基组成并高度保守的AAUAAA序列。为了保证目的mRNA能有效地多聚腺苷化，真核表达载体上必须包括多聚腺苷化下游的一端序列。最常用的方法是用SV40的一端237bp长的BamHⅠ- BclI 限制性片段，含有多聚腺苷化的信号。另一种的方法是将全长 cDNA与已组装在表达载体上一个顺式作用因子的部分片段融合，提供多聚腺苷化的信号。
（6）遗传标记： 从成千上万个哺乳细胞中，检测出极少数的含DNA重组体的转染细胞，并鉴定已导入外源DNA是哺乳动物细胞基因表达系统的一个关键内容。因此，在真核生物 表达载体上必须附有标记基因，才能进行筛选。常用的标记基因有：胸苷激酶基因（thymidine kinase，TK）、二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolate reductase，DHFR）、氯霉素乙酰转移酶基因（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）、新霉素抗性基因（neomycin resistance,NEO）等。