如题所述
说明：此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成，侵删。该课程由复旦大学生物医学研究院（IBS）的刘晓慧博士所授。
第一步：剪碎去血
将样品放入PBS缓冲溶液中剪碎，倒掉变色的溶液，换入新的PBS，继续剪，一遍一遍地重复，直到PBS溶液不变色为止。比如肝脏组织，洗完后整个是一个偏黄色的组织。在这个过程中，我们需要用剪刀和镊子剥离血管组织和脂肪组织等，这些组织的存在会对我们对样品，比如肝脏组织的蛋白质类型产生干扰。去血的过程中同时需要加入蛋白酶抑制剂。
第二步：称重
为了称量更精确，洗涤之后可以用滤纸将样品吸干，然后再称重，能比较准确地知道我们大约使用了多少组织样品。
第三步：碎裂
碎裂样品的方法在上一篇推文里有详细的介绍，包括液氮研磨、匀浆等机械破碎，温差法、压力法等物理破碎，以及加入变性剂等化学处理法。通常情况下呢，用液氮研磨就够了，研磨到完全变成粉状。但如果用单一的方法破碎效果不好，或者操作起来工作量太大，也可以进行多方法的组合。比如十几个或几十个样品，完全靠手工的液氮研磨，跟去健身房玩一圈的运动量估计也差不多了，累成狗！这时候可以考虑使用组织破碎仪，一次可以做八个十个的，一起震碎，那就轻松多了。
第四步：裂解
破碎以后，加入裂解液，反复震荡，让样品充分溶解，裂解液的用量通常是
组织重量：裂解液的体积=1：5
也就是说，1克组织，通常加入5ml的裂解液。
在裂解时，眼睛不要只顾着看手机或者盯着天花板发呆，要好好观察样品的情况，如果发现仍然有大块的组织，或者很多絮状的组织，则说明上一步碎裂的工作做得还不够。这时可以加入超声的方法，或者用组织匀浆器进一步碎裂，从而保证蛋白提取比较成功。
有哪些裂解液可选呢？
第五步：离心
裂解并震荡以后，4℃ 12000rpm离心半小时，然后吸取上清液。
说到这里，插一句，以往的经验，常规小鼠和人的组织样品，提取效率大约为0.7%，也就是说，如果有100mg的组织，能提到的蛋白大概是700 μg 。做常规的质谱分析，有100-200mg的蛋白就够了。如果样品充足，我们可以分成几份，先提取一部分做实验试试，整个流程走下来没问题的话，再提一部分，这样也比较保险，不会出现全军覆没的惨剧。余下的样本，还可以做做Western验证或者酶活啥的。
如果样品量特别少，例如小鼠卵巢，一共也就黄豆那么大，这种情况下可不能用液氮研磨，因为大部分样品都会被刮到研钵的壁上，损失很大！可选的方案是：将小鼠卵巢放进试管里，直接在管子里剪碎去血，加入裂解液，用组织破碎仪或者超声破碎，也可以用4%SDS提取（ 95℃，5分钟）。这种情况就不要弄太多的碎裂步骤了，步骤越少，样品的损失就越少。
针对动物细胞样品的处理方法有很多，我们来看看几种常见的套路：
A． 最简单的方法：
把细胞从培养皿里取出来，先加入PBS把培养基洗掉，再加入裂解液，通常25mm的培养皿加入400-700μL裂解液。然后用细胞刮直接刮取培养皿表面，不停地刮，相当于是一个机械力的破裂，而细胞表面是最容易进行破裂的。刮完后收集裂解液和细胞样品到EP管里，然后进行冰上裂解。这是最快最直接有效的方法。
B．多组细胞平行实验处理方法：
当需要处理多组细胞，而每组细胞培养的时间有间隔时，如果希望后续的分析是平行的，那么可以先分别胰酶消化以后，收集每组细胞，液氮或者-80℃保存。等各组细胞都收集好后，加入裂解液，不超过200W超声，放在冰上操作。由于不能用SDS（超声时会引起大量的泡泡），这种情况下，常用的是8M尿素或2M硫脲。超声一定要在冰上进行，因为温度特别高，很容易超过37℃，循环周期的时间通常会设定为：5秒超声，停4-5秒，再5秒超声，反复，整个过程持续5分钟左右。
C．反复冻融法：
这种方法用得比较少，因为残留的细胞残片还是比较多，我们认为提取是不充分的。
D．化学处理法：
也是非常简单粗暴的方法，直接加入4%SDS，95℃水浴，1-5分钟即可。
通常情况下，我们要求细胞量需要达到1E6的数量级。当然，有一些新发展出来的方法，需要的细胞量会非常少，比较南方医科大学田瑞军老师课题组做过1000个细胞的蛋白提取，但这些新方法对操作的要求也很高，如果你还是个新手，没有足够的经验，直接拿新方法来做，风险就会比较高了。
对于这类样品的处理，去石蜡是比较麻烦的事情。在石蜡包埋过程中，样品中的蛋白质或脂肪会用福尔马林或甲醇固定，形成交联状的结构，从中提取蛋白是非常困难的。难归难，遇到了还是要迎难而上，咱们得想一些合适的办法把蛋白有效地提取出来。通过很多次的摸索和实践，以下是比较可行的处理步骤：
第一步： 去石蜡，先用二甲苯室温浸泡5分钟，两次，再换甲醇室温浸泡5分钟，两次。看起来很简单，但整个过程中会经过混旋。
第二步： 蛋白裂解，因为蛋白被福尔马林或甲醇固定得非常紧了，有的人会选择加入水，让样品泡涨，我们更推荐加入裂解液（0.1M Tris-HCI, pH 8.0, 0.1M DTT），充分水化被固定的蛋白样品，然后匀浆和超声。
第三步： 水化之后，加入4%SDS。对于4%SDS，通常的处理条件是95℃，5分钟，但对于石蜡样品，交联特别厉害，所以推荐95℃下处理60分钟，再冷却到室温。
第四步： 离心，参数为最大相对离心力16,000 g，离心10分钟，取上清，就达到分离的目的了。
石蜡包埋样品提取的效率通常是，一平方毫米样品可提取一微克蛋白，大家可以通过这个效率值对样品中能提取的蛋白进行估算。
对于植物组织样品，难点就在于细胞壁及叶绿素的去除。
第一步： 充分再充分地研磨。由于细胞壁十分强壮，所以一定要好好地研磨，充分碎裂。一般的匀浆根本搞不定细胞壁，没办法碎得充分。
第二步： 去色素。可以通过有机溶剂多次反复沉淀样品来去除色素，比如丙酮、TCA（三氯乙酸）、甲醇，一次一次地清洗前面研磨成粉的样品，这样可以把叶绿素去掉。
第三步， 离心取沉淀，然后加入裂解液，让蛋白充分地溶解。
第四步： 进行蛋白质的抽提。在抽提的过程中，要看细胞的破碎程度或者样品的类型，叶片样品相对来说比较简单，茎的样品比较麻烦，它的纤维组织比较大，再加上植物细胞壁又比较厚，所以我们得用超声、震荡，以及各种方法组合，进行蛋白质的抽提。
第五步： 离心取上清，就得到了蛋白溶液。
根据以往经验，像叶片这类的样品，处理起来比较简单，例如水稻的叶片组织提取出来可以做到8000多个蛋白；根的样品稍微麻烦一点，因为含水量特别多，先得烘干，尽量去掉它的水份，干燥后再进行研磨提取。否则，我们可能会加入很多根，但其实能提取的样品并没有多少。花的组织，比如桃花、梨花，也是水分太多的问题，需要先干燥。种子组织，例如花生，在破碎成粉后，也需要多次使用有机溶剂去掉它的脂肪。
总之，根、茎、叶、果实等，根据不同的样品类型，我们需要根据它的特点设计不用的处理步骤，简单来说，就是通过有机试剂去掉它的色素和脂肪组织，水分太多的先烘干再提取，常规情况就是研磨和去色素。大家清楚了各种处理的用处之后，就可以针对自己的样品灵活地处理了。比如棉花样品，因为它纤维特别多，你可能就会想到得通过研磨和反复沉淀来进行纯化，再进行后续分析。
与植物样品类似，细菌样品的细胞壁也是我们提取蛋白的最大障碍，尤其是像革兰氏阳性菌，以及一些细菌的亚型，细胞壁特别厚，破碎的时候需要更强的参数，更长的时间。
刘晓慧老师分享了两个她遇到的例子：有一次做细菌样品，不巧它就是一个细胞壁特别厚的亚类，最开始采用急热骤冷，即从-80℃冰箱取出，95℃煮1分钟，反复几次，然后超声，但是提出来的蛋白量特别少。最后还是用了液氮研磨的方法，研磨之后再加入裂解液，才提取出大量的蛋白。所以，对于细菌的样品，我们可以尝试多种方法，测试一下。
还有一次做酵母样品，在做超声的时候，因为有点事情离开了，所以超声的时间就特别长，并且几次超声之间做了急热骤冷处理。另一位同事使用同样的方法，只是超声时间比较短。最后发现超声时间长的样品，破碎地非常好，显微镜下看到的都是酵母的碎片，提取到的蛋白也很多，而超声时间短的提取到的蛋白就少很多。所以我们在碎裂样品时，也可以多尝试几种方法，几种参数。
体液样品难点在于高丰度蛋白的去除。以血清为例，前14种高丰度蛋白占血清总蛋白的95%以上。而质谱是一种离子饱和性检测器，低丰度离子的信号很容易被高丰度的抑制，从而无法检测到。
我们有很多办法去掉高丰度蛋白。当然，有些情况下，为了保证样品的完整性，也有人不去除高丰度蛋白，这个视具体情况而定。另外，高丰度蛋白可能还会与一些低丰度蛋白相结合，当我们去掉高丰度蛋白时，往往就会将这些有意义的低丰度蛋白也去掉，无法保证分析的完整性。针对这种情况，用普通的shotgun方法是很难解决的，后面我们会介绍一种方法，它在高丰度蛋白存在的情况下，仍然可以稳定地可重复地鉴定到很多中低丰度的蛋白。
要去除高丰度蛋白，很多商业试剂盒都可以帮到我们。它们的原理各有不同，我们来看几个比较常用的。
第一种是Bio-Rad的Proteominer试剂盒。
这类试剂盒的原理是：通过一个六肽配基与高丰度蛋白结合，从而进行去除。这种方法是非抗体型的，没啥特异性，它不受物种限制和样品类型限制。当样品进来时，六肽配基会优先结合丰度高的蛋白质，丰度低的嘛，结合的机会小很多，于是就达到了分离去除的目的。
通过这个办法处理后，最终能鉴定到的蛋白也是比较多的，从鉴定的数量上看，与安捷伦的特异性试剂盒差不多。但如果要发高分的文章，用这种方法容易受到质疑，也是因为它的特异性不强，去高丰度有一定的随机性，高分杂志不太接受这种随机的方法。但如果你的样品体积特别大，可以先试着用Proteominer做一次，接下来再使用一些特异性的去高丰度蛋白的方法。或者你的样品没有特异性抗体柱可以用的话，也可以考虑这种方法。
第二种是安捷伦的MARS柱。它含有14种蛋白抗体，针对血清中的高丰度蛋白能很有针对性地去除，需要的样品量通常为20μL-40μL，20μL的血清样品可以得到约100微克的蛋白样品，40μL的量足够我们做一次iTRAQ或label free实验了。
第三种试剂盒是Thermo的Pierce Albumin/IgG的试剂盒，可以去两个高丰度蛋白。现在出了一个去20个高丰度蛋白的试剂盒，这是基于抗体方法，针对性很强，是比较公认的方法。
第四种是SIGMA公司的Human IgY14 and SuperMix Columns，2015年MCP上发表了一篇文献，里面用到这个试剂盒，先是用特异性柱子去掉14个高丰度蛋白，然后再特异性去掉50个中丰度的蛋白，最后可以鉴定到5300多个血清蛋白质。对比现在常规的方法，通常只能鉴定到500-600个血清蛋白，如果高丰度蛋白去除得比较好，用QE的方法做，也只能鉴定到1000个左右蛋白。这篇文章鉴定出了5300个蛋白质，在血清样品的蛋白鉴定中确实是一个相当outstanding的结果了。
以上是四种比较常用的去高丰度的试用盒。总的来说，针对像尿液这类体积很大的样品，可以用Proteominer的方法，因为其余的基于抗体的方法都对蛋白含量有所要求。去掉高丰度蛋白后，我们可以对尿液先进行浓缩，使它的浓度达到50μg/μL或更高，再进行后续的蛋白提取，效果会更好。另外，尿液样品也可以通过沉淀的方法对蛋白进行提取。
另外，像脑脊液样品，也可以通过Proteominer方法进行提取，它的蛋白含量也比较低。刘晓慧老师组尝试过用安捷伦的特异性去除14个高丰度蛋白的试剂盒与Proteominer的随机去除6个高丰度蛋白试剂盒进行比较，最后能检测到的蛋白结果都差不多。
针对亚细胞器的提取，我们分几步来完成：
第一步： 对组织或细胞进行匀浆，不需要匀得非常碎，通常匀个10-20下就可以了；
第二步： 初步分离，使用差速离心的方法，具体说明见上图。
第三步： 用蔗糖密度梯度离心进行再分离。蔗糖密度梯度是连续的，那么相应的亚细胞器会在等密度的蔗糖密度区间内沉积。于是，可以将溶酶体、线粒体，以及其它微体分开。然后取出对应的细胞器，再进行裂解和提取。
第四步： 对亚细胞器进行验证。这一步需要引入Western，比如用到一些线粒体特异的抗体，或者细胞膜、细胞核特异的抗体，进行样品纯度的确证，之后再进行后续的实验。否则，如果样品中有污染，会给后续的实验带来很难解释的问题。
以上是针对不同样品的蛋白提取方法，下一篇将继续分享样品前处理的余下几步，即蛋白提取的质量控制、脱盐、还原烷基化和酶解。
