如题所述
在做蛋白表达与纯化的路上，总是充满著各种各样的挑战，要么蛋白无法表达，要么表达的蛋白检测不到……尤其是当纯化的蛋白在包涵体中，不溶，不挂柱，这可怎么办呢？所以，如果前期花点时间优化实验设计，将会大大节约后续纯化的时间，省去不必要的麻烦。比如，要纯化包涵体，首先需要了解…
什么是包涵体？
通常所说的包涵体（Inclusion Bodies, IB），是指细菌（或原核生物细胞）中表达的非结晶、无定形结构的蛋白质聚集体1。在大肠杆菌中表达重组蛋白时，大约有70% 的重组蛋白以包涵体的形式存在2。包涵体无生物活性，难溶于水，但可溶于变性溶剂如尿素、盐酸胍等1。将包涵体溶解后，即可离心并纯化相应的上清。
目前，除离子交换法、疏水法之外，亲和层析法是一种被广泛使用的包涵体纯化方法。将蛋白加上标签后，其可以与连接有配体的层析介质特异性结合，以此分离纯化。在众多的纯化标签中，有两个标签可以用来在变性条件下纯化蛋白——His-tag 和 Strep-tag 。这两种标签都属于重组蛋白表达中常用的标签，至于两者之间的对比，在这里给大家列出一张表格以供参考：
（图片来源：哺乳动物细胞表达的难点和解决方案，都帮你整理好了）
为了比较两种标签的实际纯化效果，这里做了两个小测试。分别在天然条件和变性条件下，将mCherry， GAPDH 或目的蛋白，与标签His6-tag 和Twin-Strep-tag® 重组，表达后，在两种标签各自的纯化条件下进行纯化，跑胶观察结果。
在配体的选择上， His6-tag 重组蛋白使用 Ni-NTA 纯化， 而 Twin-Strep-tag® 重组蛋白则使用填料Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XT（IBA Lifesciences，德国）进行纯化。
（图片来源：iba）
Twin-Strep-tag® 标签搭配 Strep-Tactin®XT 组合而成的第三代 Strep-tag® 高效蛋白纯化系统（如下图），有接近共价的高亲和力。
（图片来源：iba）
Protocol
克隆与表达
1. 将编码mCherry，GAPDH 和目的蛋白克隆至表达载体中（IBA Lifesciences），构建Twin-Strep-tag® 和His6-tag 重组蛋白表达载体，后将载体分别转化至大肠杆菌BL21 中，表达并收集菌体（IBA Lifesciences Protocol PR86-0001）。在含氨芐青霉素的 LB 或 HD 培养基中培养菌体，并以合适的光密度诱导。 2. 收集菌体并重悬于缓冲液中。 His-tag 重组蛋白使用Ni-NTA Lysis Buffer（50 mM NaH2PO4，pH 8.0,300 mM NaCl 10 mM 咪唑）; Twin-Strep-tag 重组蛋白使用Buffer W（100 mM Tris / HCl，pH 8.0,150 mM NaCl ; 使用1 mM EDTA）。 3. 超声破碎，并离心。
纯化
「天然条件：mCherry，GAPDH」
1. 使用 Ni-NTA Lysis Buffer 和 Buffer W 分别平衡 1 mL Ni-NTA，Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XTSuperflow® 纯化柱，后将得到的蛋白上清液取 3 mL 加入柱中。 2. 使用2 CV（Column Volume, 柱体积）的Ni-NTA Wash Buffer（50 mM NaH2PO4，pH 8.0,300 mM NaCl 20 mM 咪唑）清洗Ni-NTA 柱4 次，1 CV 的Buffer W 将两个Strep -Tactin® 柱清洗8 次。 3. 使用 0.5 CV 的洗脱液洗 6 次。
洗脱液：Ni-NTA：50 mM NaH2PO4 pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM 咪唑 Strep-Tactin®：Buffer E（Buffer W + 2.5 mM 脱硫生物素） Strep-Tactin®XT：Buffer BXT（Buffer W + 50 mM 生物素）
变性条件：目的蛋白
1. 室温条件下，细胞沉淀在缓冲液中持续搅拌溶解 15~60 分钟，后离心。 缓冲液：Buffer W：（含有 8M 尿素，Twin-Strep-tag®） Buffer B：（100 mM NaH2PO4 pH8.0 10 mM Tris / HCl 8M 尿素; His-tag） 2. 上柱前，使用 Buffer W 将溶解的蛋白稀释至尿素浓度为 4M 和 6M, 用于 Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XT 纯化。 3. 使用含有适当浓度尿素的 Wash Buffer 平衡纯化柱 1 mL Ni-NTA，Strep-Tactin®，和 Strep-Tactin®XT。取含之前有蛋白的上清，加入柱中。 4. 使用 1 CV 含有尿素的 Buffer W 或 Buffer C 清洗纯化柱，反复清洗直到 A 280 nm 低于 0.1 或者达到恒定为止。 5. 使用 0.5 CV 的洗脱液洗 6 次。 洗脱液：Ni-NTA：Buffer D1 ：100 mM NaH2PO4， pH 5.9， 10 mM Tris / HCl 8M 尿素：Buffer D2（pH 4.5 的 Buffer D1）用于洗脱第二步。 Strep-Tactin®：Buffer E + 尿素 Strep-Tactin®XT：Buffer BXT + 尿素
最后通过 SDS-PAGE 分析所有洗脱组分，并用 Nanodrop 测蛋白浓度。
结果
对比 SDS-PAGE 分析，可发现 Strep-tag® 系统使用流程简便，在天然还是变性条件下纯化的蛋白，纯度皆高于 His-tag 系统。
– 比较第三代 Strep-tag® 系统 （左）与 His-tag 系统（右）在 native 条件下，纯化 mCherry 及 GAPDH 蛋白的表现
无论是 mCherry 或是 GAPDH，使用 Strep-tactin®XT : Twin-Strep-tag® 都能得到纯度较高的目标蛋白（见 Elution）。
Western blot 分析结果显示，提取 mCherry 所出现的杂质为其降解产物。
（图片来源：iba）
比较 His-tag 系统（左）与第二、三代 Strep-tag® 系统（中、右）在变性条件下，纯化不同蛋白的效果
使用第三代 Strep-tactin®XT 能在使用 6M 尿素的变性条件中，获得大量高纯度的蛋白；相对而言，使用 Strep-tactin® 仅能得到极少量蛋白。
而使用 Ni-NTA 虽然能在将 pH 值调降至 4.5（E2）情况下，纯化蛋白，但得到的最终产物仍含有许多杂质。
（图片来源：iba）
因此，综合下来我们可以发现，Strep-Tactin®XT：Twin-Strep-tag® 在天然条件下和变性条件下纯化的蛋白都有很高的纯度。
操作上，His-tag 系统在洗脱时需要不同 pH 的 2 种 Buffer 来达成。而 Strep-Tactin®XT 的操作步骤则较为简单，且 Buffer 中不含咪唑，不会干扰 260/280 nm 的测定，也省去后续除咪唑和脱盐等步骤。更多资料表明，Strep-Tactin®XT 不仅能在温和的纯化流程中产出高纯度（纯度>95%）、高产量的目标蛋白，且能保持目标蛋白的活性。此纯化系统在有表面活性剂的环境中也有良好的纯化表现，柱子可以多洗几次，不会造成目标蛋白流失。即便是量少的蛋白或是膜蛋白，也有良好的纯化效率。
（图片来源：iba）
同时Strep-Tactin®XT 还可用于变性条件下的纯化，或WB/ELISA，侦测目标蛋白，还可用来固定目标蛋白，检测蛋白质交互作用，或是更进一步用以筛选治疗用蛋白，工业用酵素等等，具有广泛的应用领域。
（图片来源：iba） 参考文献： 1. Palmer I, Wingfield PT, 2004: Curr Protoc Protein Sci. 38:6.3:6.3.1–6.3.18. Preparation and Extraction of Insoluble (Inclusion-Body) Proteins from Escherichia coli. 2. Yang Z, Zhang L, Zhang Y, Zhang T, Feng Y, Lu X, et al. (2011) Highly Efficient Production of Soluble Proteins from Insoluble Inclusion Bodies by a Two-Step-Denaturing and Refolding Method. PLoS ONE 6(7): e22981. doi/10.1371/journal.pone.0022981 文章来源：iba 题图来源：站酷海洛 话题： 包涵体, 蛋白
