如题所述
α-BGT的cD-NA序列包括信号肽序列，编码成熟蛋白的序列和5，，3，-UTR序列。不同来源的α-BGT的cDNA有很高的同源性，其中信号肽序列和5，，3，-UTR序列保守并与眼镜蛇科和海蛇科的序列完全一样，由此可以推断它们由同一个祖先进化而来的。α-BGT的cDNA全长约500 bp，其中5，-端约30bp，3，-端约200 bp为非蛋白编码区域。编码区编码一个由21个氨基酸残基组成的信号肽和一个74个氨基酸残基组成的成熟蛋白质。Liu等从毒腺中提取α-BGT的总mRNA，扩增了α-BGT cDNA片段，其全长为530 bp，5，-UTR 33 bp，信号肽63 bp，编码区222 bp，3，-UTR 195 bp，有一个终止密码子TGA和AATAA信号polyA序列。α-BGTmRNA在同一个体中也存在多样性，是由转录后编辑形成，还是由于实验中反转录过程的错误、基因克隆中的偏差以及测序过程的误差造成，或两者都有，一直存有争论。
α-BGT的基因组DNA有3个外显子，被2个内含子分隔开。外显子、内含子连接遵循GT/AG法则，序列和3，-UTR是高度保守的，TATA盒位于转录起始位点上游25~33 bp。Chang等从银环蛇毒中提取了2个约2700bp的基因组DNA，即α-Bgt（A31）和α-Bgt（V31），它们表现出完全一样的基因结构，含有3个外显子基因，在同样的位置插入2个内含子，且它们的核苷酸序列具有98%的同源性。内含子1的长度约为1800 bp，内含子2的长度约为540bp。跟短链神经毒素相比，发现内含子2的长度变化比较小，比内含子1保守，短链神经毒素和长链神经毒素的外显子区域比内含子区域更具多样化。林鲁萍用扩增得到2655 bp的α-BGT基因。α-BGT编码区共有288 bp，第1个外显子包括58 bp的编码区部分，编码信号肽部分N端的20个氨基酸；外显子2全长105 bp，编码信号肽剩余的4个氨基酸和成熟肽N端的33个氨基酸；外显子3全长128 bp，包括编码剩余41个氨基酸部分和1个终止密码子，翻译出来的蛋白序列符合V31变体。得到序列的2个内含子分别为1790 bp和538 bp。
从银环蛇毒中已分离出7种β-银环蛇毒素异构体，除了A2链外，A1和A3链的cDNA还未克隆到。另外4个A链异构体（A4-A7）的cDNA已被克隆，3个B链cDNA已被克隆。现代色谱技术及氨基酸分析揭示至少有16种β-BGT亚型。A链与B链的分开可用还原链间，也可用2-巯基乙醇还原，然后用碘乙酸烷化。Long-Sen Chang等通过β-BGT的A链和B链基因，分析A链和B链基因的编码区，发现有3个外显子被2个内含子分隔开，外显子和内含子连接遵循GT/AG法则。分析启动子序列，得出结论：A链和B链由不同的基因编码。这个结论支持完整的β-BGT来自转录后的A链和B链配对这个观点。克隆到的A链样基因全长3022 bp，外显子1编码5，-UTR，25个氨基酸残基组成的信号肽和氨基酸残基1-43，外显子2编码氨基酸残基43-81，外显子3编码氨基酸残基81-120和3，-UTR。克隆到的B1链基因长5062bp，外显子1编码5，-UTR，24个氨基酸残基组成的信号肽，氨基酸残基1-5，外显子2编码氨基酸残基5-59，外显子3编码氨基酸残基59-61和3，-UTR。
Cheng等根据β-BGT的B1链启动子区域，非编码区，B1链cDNA分别设计引物，扩增从银环蛇提取的β-BGT的基因组，克隆到B1、B2、B4、B5、B6链的基因组，B2、B4链的长度分别为4699 bp、3243 bp。B5、B6链约为2000 bp，但不包括启动子序列。同源比较6条B1链的氨基酸序列，显示信号肽有24个氨基酸组成，2个内含子在相同的位置分隔编码区域，B2和B4链第61位上的氨基酸不同，B5、B6在C末端和N末端缺少2个氨基酸，但是所有的B链都有7个，位于7个不同的保守位点。比较6条链的基因组，发现内含子1长度几乎一样，内含子2长度变化很大，B4、B5、B6链缺少内含子2的2个区域，但是6条链在剪接位点附近的内含子2的序列是高度保守的。和眼镜蛇的胰凝乳蛋白酶抑制剂基因作比较，发现有共同的基因组结构，而且核苷酸序列高度相似。
在研究银环蛇毒蛋白酶抑制剂类蛋白质（PILP）时，Chang等克隆并表达了PILP-1，PILP-2，PILP-3。蛋白酶活性试验表明，重组PILP-1能抑制胰蛋白酶的活性。比较PILP和B链的基因序列，发现有相同的基因结构，除了编码信号肽的外显子外，编码蛋白质的外显子比内含子更具多样性。这表明，PILP基因和B链基因起源于公共的祖先，进化的加速可能使PILP基因和B链基因具多样化。Wen-MinChou等发现PILP-3还是基质金属蛋白酶-2的抑制剂，能抑制的侵袭和迁移。 蛇毒神经毒素主要来源于捕蛇或养蛇提取蛇毒后进行纯化的方法进行。银环蛇由于人工养殖成本高、周期长、越冬存活率极低，因此通过人工养殖获得大量银环蛇毒有较大困难，而野生银环蛇也由于过度捕猎使银环蛇种群数量逐年下降，加上银环蛇列入国家一级保护野生动物，从野生来源获得银环蛇毒也有很大问题。因此从天然蛇毒中分离纯化得到足够数量的α-BGT、β-BGT以供科学研究和临床治疗比较困难，而通过得到足够的α-BGT、β-BGT成为一条很好的途径。
钱友存等从银环蛇毒腺中抽提总RNA，RT-PCR扩增编码β-银环蛇毒素A链的cDNA，克隆并测定了一个新的β-BGT-cDNA全序列，命名为A7链，编码含有27个氨基酸的信号肽和120个氨基酸的成熟蛋白，该成熟蛋白和其他β-银环蛇毒素A链一样，具有13个位置固定的半胱氨酸，而且和这些A链具有很高的同源性。将β-银环蛇毒素A链cD-NA亚克隆到表达载体pMAL-p2上，转化大肠杆菌BL21菌株，得到高效的可溶性融合蛋白，表达产物经Xα因子酶切后显示较弱的磷脂酶A2活性。为阐明磷脂酶A2的作用机制和生物活性的研究提供了材料。
Wu等构建了β-银环蛇毒素B链（B1和B2）的cD-NA。B链cDNA编码24个氨基酸组成的信号肽和为起始的由61个氨基酸组成的成熟蛋白。B1链cDNA全长425 bp，B2链cDNA全长328 bp。将B链亚克隆到表达载体PET-32α（+），转化大肠杆菌BL21（DE3）。用His-Bind树脂柱纯化表达的硫氧还蛋白融合蛋白。B链用Ser代替Cys-55，亲和纯化的融合蛋白量至少增加100倍。如果用肠激酶切掉融合的硫氧还蛋白，则分离的B链不溶于水。 林鲁萍等用已经构建的pGEX-BgTX（P22-A31）质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中表达，并用SepharoseFF纯化GST-α-银环蛇毒素融合蛋白，再用凝血酶切掉融合标签谷胱苷肽转移酶（Glutathione S-transferase，GST），得到了较纯的重组α-银环蛇毒素同工毒素，得率约为1.225 mg/L。用重组α-银环蛇毒素制备多克隆抗体，经ELISA和Wastern杂交鉴定后确定重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素的抗原性一致。
胡延春等将扩增获得的α-BGT基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT，克隆质粒双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行IPTG诱导表达，表达产物经15% SDS-PAGE分析，得到约34 kD的重组α-BGT，其表达量约占细菌总蛋白的32.16%。Wastern blotting和间接ELISA检测结果表明，α-BGT的融合表达蛋白也与天然的α-BGT标准品具有相似的抗原性。在大肠杆菌BL21（DE3）中的非融合型表达α-BGT占细菌总蛋白的11.98%，主要以包涵体形式存在，也与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。α-BGT基因失望克隆、表达和活性研究，为改造α-BGT基因，降低其毒性和用表达的重组α-BGT研究乙酰胆碱受体提供了有效的途径。
通过以上研究证明，用基因工程的方法获得蛇神经毒素是可行的，且融合表达效率高，具有较好的可溶性。得到的重组毒素蛋白具有一定的生物活性，并与天然的蛋白有相似的免疫原性。但表达的重组α-BGT、β-BGT与天然的蛋白相比生物活性有所降低，这可能是因为α-BGT、β-BGT都具有多对二硫键，从而造成无论真核还是原核表达都不能完全正确折叠恢复成天然构象，也可能是在表达纯化的过程中一些试剂的影响，使部分蛋白构象改变而导致生物活性降低。 α-BGT与乙酰胆碱受体结合的亲和力高，因此是研究乙酰胆碱受体结构的理想探针，可用于显示完整表面乙酰胆碱受体的分布和密度，观察各种药物、毒物和其他致病因子对乙酰胆碱受体动力学变化的影响，也是从组织中分离和纯化乙酰胆碱受体的重要工具。20世纪70年代末，应用I125标记的α-BGT作配体来探测nAchR的数量对阐明（myastherniagravis，MG）的发病机制起了极大的作用。MG是nAchR，利用α-BGT纯化的nAchR作为抗原，免疫接种于动物，可制成自身免疫性重症肌无力的模型，为免疫调节诊疗的研究提供了必不可少的工具。莫雪安等利用α-BGT能特异性地不可逆地与后膜乙酰胆碱受体结合，β-BGT能特异性地不可逆地与突触前膜的相应蛋白质结合的特性，将α-BGT和β-BGT混合一起包被酶标板，结合随后加的肌肉提取液中相应蛋白质为抗原，以ABC-ELISA法检测重症肌无力病人血清中混合的抗乙酰胆碱受体抗体（AchRab）和抗突触前膜受体抗体（PsmRab），称为抗突触受体抗体。结果：75名正常人均阴性。80例临床对照组中，除2例和1例多发性肌炎阳性外，其余均阴性。122例重症肌无力病人中98例阳性（80.3%，其中全身型阳性87.5%），阳性率明显高于单独检测AchRab（P<0.001）。创建了重症肌无力诊断的一个阳性率较高的实验室指标。
Yang和Chang在1998年利用杂交瘤技术制备了23种抗β-BGT单克隆抗体，其中7株可抑制β-BGT70%的PLA2的活性并中和毒素，在这7株中和单抗中有6株可识别A链上连续抗原表位，1株识别毒素的共同表位。 利用合成肽段及蛋白酶分析确定了A链上6种单抗识别的氨基酸位点，其中单抗17识别位点31-37，单抗2和8识别46-51，单抗21和22识别91-98，单抗6识别100-106。水化位点分析显示单抗17、21和22识别的抗原表位在亲水区，单抗2和8的识别表位在中性区。一方面，抗原的外形结构信息预示单抗21和22的识别表位具有高免疫原性，单抗2和8的识别表位具有中等免疫原性，而单抗6和7的识别表位具有低免疫原性。链的弹性分析表明单抗2、8、17、21和22的识别表位在中等弹性区域，而单抗6的识别表位则位于低的弹性区域。从这些可以看出单抗6识别的抗原表位位于一个亲水、钢性和不易接近的位置，表明这个区域抗原性不高。在单抗2和8的结合位点46-51上存在PLA2酶活性所必需的His-48和Asp-49两个位点，所以封闭这两个位点能够抑制β-BGT的酶活性和神经毒性，由于单抗8的亲和活性大于单抗2，所以单抗8抑制β-BGT的酶活性和神经毒性的能力更大一些。同样Asp-92也是PLA2酶活性所必需的位点，因此单抗21和22也能抑制β-BGT的生物活性。参考牛胰PLA2的晶体结构，Tyr-28、Gly-30D羧基，Gly-32，和氧笼一起捕获Ca2+。从以上观察可知单抗17能够结合Gly-32，从而抑制β-BGT的PLA2活性。
竞争性抗体结合抑制实验表明这些中和抗体与抗原的亲和性与合成的短肽兼容。利用合成的短肽A（31-37）、A（46-51）、A（91-98）和A（100-106）含有β-BGT的中和抗原表位，将这些短肽与BSA偶联，注射小鼠，4周后小鼠体内抗体达到最高水平，可起到很好的免疫保护作用，为研究毒素疫苗做了准备。1999年Yang和Chang利用木瓜蛋白酶水解纯化的单抗制备并研究了Fab片段的活性。通过研究Fab片段组成的可溶性复合物的分子量表明β-BGT、A链及B链的抗原决定簇数目分别为7、5和2。另外23种β-BGT单抗还用来确定β-BGT与β-BGT家族其他成员及其他毒素的交叉反应。
