如题所述
第1个回答 2022-07-18
原核表达的核心其实用到的是分子生物学中我们学过的乳糖操纵子模型。
乳糖操纵子模型主要有负调控和正调控，这里主要用的是负调控的机制。
我们使用IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）做为诱导剂。在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，抑制转录启动。当有乳糖存在时，去阻遏后lac操纵子即可被诱导。
注：真正的诱导剂并非乳糖本身，糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，因此两者均可以作为原核表达的诱导剂。IPTG在作为诱导剂参与原核表达的进程，单其本身并不被消耗。所以在阻遏时也有微量基因转录
使用载体 以pET-28载体为例
Origin：由复制起始位点和相关调控元件组成，pET-28a(+)中的复制子属于松弛型中低拷贝型复制子，目标蛋白的高表达会对宿主菌造成较大的压力，所以表达载体的拷贝数通常较低。
Kan：编码氨基糖苷磷酸转移酶，使质粒产生卡那霉素抗性，用于筛选培养过程中含有目标质粒的宿主菌。
Rop：编码ROP蛋白 ，ROP蛋白是一种复制调控蛋白，将质粒的拷贝数维持在15-20，该元件缺失会导致质粒拷贝数升高。（拷贝数的限制者）
T7 promoter：来源于T7噬菌体，受控于T7 RNA聚合酶的启动子，是当今大肠杆菌表达系统的主流。T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。（蛋白表达的调控区）
6xHis：六个组氨酸组成的标签，在MCS区C端和N端各有一个，可以采用固定化金属螯合层析IMAC对重组蛋白进行分离纯化。我们用的在N端，C端加stop code。
具体的原理如图：阻遏蛋白结合LacO,防止T7启动子启动，受诱导后去阻遏。
预实验：
1.吸取表达载体转入大肠杆菌 BL21(DE3) ，一管子一般可以转10个，转化步骤同正常大肠杆菌转化。
该感受提缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，从而减少对重组蛋白的降解，补充大肠杆菌缺乏4种稀有密码子( AGA、AUA、CCC、CUA)对应 tRNA （argU、ileY、proL、leuW）提高外源基因，尤其是富含AT-或 GC-的真核基因在原核系统中的表达水平。该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区（DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶），可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。
2.过夜后挑取单菌落划线，用含对应抗生素的 LB 液体培养基过夜孵育，过饱和菌液保存菌种备用。
3.取 0.1 mL 过饱和菌液，加入到 10 mL 培养基中，在 37℃孵育至 OD600 为 0.5；实际时间大概不到一个小时,OD0.4-0.8 都可以，此时保存40ul菌液是为诱导前（BI）。
4.向菌液中加入 1/1000 1 M IPTG，即10μL。放入 18℃温箱中培养过夜 (或 37℃孵育 4 h)，保存40μL是为诱导后（AI）。
5. 4,000 rpm，15 min，室温收集菌体
6. 用加入1％ 的100mM的PMSF(苯甲基磺酰氟) 及100*Cocktail(1mL 2*) 的裂解缓冲液重悬菌体，转至尖底 50 mL 管，放在烧杯之中。
7.用超声裂解菌体，将烧杯内放置冰，10s破裂，20s间隙，警戒温度60℃，共计10min，可五分钟观察一次，如果体系过大，则超声时间时间延长。
8.将裂解后的细胞，转到2mL离心管（共五管），如体系大，则转到圆底离心管便于离心。4℃ 12000rpm 15min。
9.取上清和沉淀各40μL，上清（SP）和沉淀（CP）。
10.加入loading（一共10μL）和Marker（3μL）
11.考染观察结果。
乳糖操纵子模型主要有负调控和正调控，这里主要用的是负调控的机制。
我们使用IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）做为诱导剂。在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，抑制转录启动。当有乳糖存在时，去阻遏后lac操纵子即可被诱导。
注：真正的诱导剂并非乳糖本身，糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，因此两者均可以作为原核表达的诱导剂。IPTG在作为诱导剂参与原核表达的进程，单其本身并不被消耗。所以在阻遏时也有微量基因转录
使用载体 以pET-28载体为例
Origin：由复制起始位点和相关调控元件组成，pET-28a(+)中的复制子属于松弛型中低拷贝型复制子，目标蛋白的高表达会对宿主菌造成较大的压力，所以表达载体的拷贝数通常较低。
Kan：编码氨基糖苷磷酸转移酶，使质粒产生卡那霉素抗性，用于筛选培养过程中含有目标质粒的宿主菌。
Rop：编码ROP蛋白 ，ROP蛋白是一种复制调控蛋白，将质粒的拷贝数维持在15-20，该元件缺失会导致质粒拷贝数升高。（拷贝数的限制者）
T7 promoter：来源于T7噬菌体，受控于T7 RNA聚合酶的启动子，是当今大肠杆菌表达系统的主流。T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。（蛋白表达的调控区）
6xHis：六个组氨酸组成的标签，在MCS区C端和N端各有一个，可以采用固定化金属螯合层析IMAC对重组蛋白进行分离纯化。我们用的在N端，C端加stop code。
具体的原理如图：阻遏蛋白结合LacO,防止T7启动子启动，受诱导后去阻遏。
预实验：
1.吸取表达载体转入大肠杆菌 BL21(DE3) ，一管子一般可以转10个，转化步骤同正常大肠杆菌转化。
该感受提缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，从而减少对重组蛋白的降解，补充大肠杆菌缺乏4种稀有密码子( AGA、AUA、CCC、CUA)对应 tRNA （argU、ileY、proL、leuW）提高外源基因，尤其是富含AT-或 GC-的真核基因在原核系统中的表达水平。该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区（DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶），可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。
2.过夜后挑取单菌落划线，用含对应抗生素的 LB 液体培养基过夜孵育，过饱和菌液保存菌种备用。
3.取 0.1 mL 过饱和菌液，加入到 10 mL 培养基中，在 37℃孵育至 OD600 为 0.5；实际时间大概不到一个小时,OD0.4-0.8 都可以，此时保存40ul菌液是为诱导前（BI）。
4.向菌液中加入 1/1000 1 M IPTG，即10μL。放入 18℃温箱中培养过夜 (或 37℃孵育 4 h)，保存40μL是为诱导后（AI）。
5. 4,000 rpm，15 min，室温收集菌体
6. 用加入1％ 的100mM的PMSF(苯甲基磺酰氟) 及100*Cocktail(1mL 2*) 的裂解缓冲液重悬菌体，转至尖底 50 mL 管，放在烧杯之中。
7.用超声裂解菌体，将烧杯内放置冰，10s破裂，20s间隙，警戒温度60℃，共计10min，可五分钟观察一次，如果体系过大，则超声时间时间延长。
8.将裂解后的细胞，转到2mL离心管（共五管），如体系大，则转到圆底离心管便于离心。4℃ 12000rpm 15min。
9.取上清和沉淀各40μL，上清（SP）和沉淀（CP）。
10.加入loading（一共10μL）和Marker（3μL）
11.考染观察结果。
