如题所述
对虾免疫相关基因QM的功能研究 对虾白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus,WSSV)是危害养殖对虾的最主要病原,其致病能力强,传播范围广,给世界对虾养殖业造成了巨大的损失,然而至今仍无有效的防治方法。要进行病害的有效防治,必须了解对虾免疫的机理。本论文首先利用WSSV建立对虾病毒基因功能研究的RNAi技术,在此基础上开展对虾QM蛋白在对虾免疫过程中的作用研究,为建立有效的对虾病害防治方法提供科学依据。采用RNAi方法,选择在WSSV的感染中起重要作用的vp28基因(编码WSSV主要的膜蛋白)作为干扰目的基因,在体外合成siRNA后,利用体外注射的方法进行干扰实验。结果发现vp28基因的转录和表达被序列特异的siRNA干扰抑制,此时用竞争性定量PCR检测发现,对vp28进行干扰后,显著降低对虾体内的病毒粒子拷贝数,同时能延缓对虾的死亡。因此,在WSSV中建立了基因功能研究的RNAi方法。在重复注射3次siRNA后,对虾体内WSSV被完全清除,说明RNAi在对虾体内具有抗病毒效果,这为对虾白斑综合症病毒(WSSV)的防治提供一种新的有效方法。通过RACE等得到对虾QM基因(PjQM),序列分析发现,PjQM具备QM蛋白的基本特征和功能结构域。对该基因进行了原核表达,并纯化得到融合蛋白。RT-PCR和Westernblot分析发现,PjQM在对虾各组织中均有转录和表达。Real-timePCR分析发现,在受到病毒刺激后PjQM基因表达上调,说明PjQM参与了对虾的免疫过程。通过GST下拉、质谱鉴定等分析发现,PjQM蛋白与血蓝蛋白、肌球蛋白(myosin)之间存在相互作用,进一步的体外和体内试验证明,PjQM与血蓝蛋白之间确实存在互作。蛋白质互作提示,PjQM可能通过酚氧化酶激活系统等途径参与对虾免疫。采用上述在WSSV基因功能研究中建立的RNAi技术,研究PjQM的功能。Northernblot和Westernblot结果显示,PjQM基因的转录和表达被PjQM序列特异的siRNA抑制,此时对虾酚氧化酶(PO)活性显著下降。因此,RNAi试验结果表明,QM可调控对虾酚氧化酶(PO)活性。以上研究结果说明,QM蛋白参与抗病毒免疫的可能途径之一是,QM通过与血蓝蛋白的互作,调控PO的活性。这是首次发现QM在动物免疫反应中起作用。
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