如题所述
(1)通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
(2)通过RT-PCR方法:提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 (1)载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
(2)PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 (1) 将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
(2)测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
(3) 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
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