如题所述
Ni柱中的氯化镍可以与有HIs(组蛋白)标签的蛋白结合,也可以与咪唑结合。
步骤是:过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里,留下来了,当然肯定有少量杂蛋白也挂上了,这时候你要梯度洗脱,拿咪唑和你的buffer配,一般从0 20mM 40mM。。。。100mM这样洗脱(当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候)我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来,洗完之后,你可以用200mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次,是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~
过的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page检测在哪个管子里。
这是我的经验,楼主可以多方面参考下别人的。喜欢推荐我的答案哦,~\(≧▽≦)/~
步骤是:过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里,留下来了,当然肯定有少量杂蛋白也挂上了,这时候你要梯度洗脱,拿咪唑和你的buffer配,一般从0 20mM 40mM。。。。100mM这样洗脱(当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候)我指的是咪唑的终浓度。咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来,洗完之后,你可以用200mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次,是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~
过的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page检测在哪个管子里。
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第1个回答 2011-07-14
楼上说的基本对,但基本上里面填料时硫酸镍,因此柱子可以和碱性蛋白结合,组蛋白标签一般是6个组氨酸(碱性氨基酸)。在蛋白上样后,带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里,其他的杂蛋白流出。这时候再用咪唑洗脱,梯度洗脱,咪唑竞争性结合到硫酸镍上,目的蛋白就被洗脱了,这时候收集浸出液,那么里面就是你要的目的蛋白,然后透析掉咪唑就行了。现在的柱子大多是预装柱,也就是不用自己填柱,就是装好镍的傻瓜柱,也不贵,上样,洗脱,基本两个步骤就结束了。剩下的看你怎么处理了。可以参考楼上的。不会再问。
第2个回答 2011-07-14
学习