包涵体实验方法

在进行包涵体实验时，首先采取的是机械破碎，通过物理手段破坏细胞结构。接着，超声破碎技术也被广泛应用，通过高频声波促使包涵体裂解。然而，这些方法后，包涵体通常与脂体和部分细胞膜及膜蛋白紧密结合，因此需要进行洗涤步骤。常用的洗涤方法是使用低浓度的变性剂，如2M尿素在pH7.0-8.5的Trisp缓冲液中，有时还需添加1mMEDTA去除膜碎片和膜蛋白。去垢剂TritonX-100也能用于温和地清洗这些杂质，但需注意，强阴离子去垢剂SDS如若过量使用，会破坏蛋白的疏水性，因此在制药过程中要避免。

极端pH值也能够帮助溶解蛋白，比如在pH值大于9.0时，牛生长激素和牛凝乳蛋白酶的包涵体可以被溶解。60mM的盐酸可以溶解部分蛋白。然而，这些方法并不适用于所有蛋白，且需谨慎使用，因为它们可能仅适用于特定的蛋白类型。

变性剂的使用至关重要，一般在碱性环境中，如pH8.0-9.0，尿素在此环境中不稳定，因此推荐在pH1.0以下使用。盐酸胍对某些蛋白如IL-4有特定效果，增溶过程通常在室温下过夜，但盐酸胍在37度下1小时就可完全溶解蛋白。还原剂如2-BME或DTT在增溶过程中起到重要作用，浓度一般为50-100mM，而一些没有二硫键的蛋白则无需还原剂。对于目标蛋白的复性，通常从4M尿素浓度开始，逐渐降至2M，而对于盐酸胍，从4M开始，至1.5M时复性过程已完成。

复性过程中，通过逐步降低变性剂浓度和去除还原剂，目标蛋白会从伸展状态恢复到正常折叠结构，确保其功能完整。常见的复性方法包括逐步降低尿素浓度和控制还原剂的去除时机。

包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞等。包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。