如题所述
GST融合蛋白沉降技术是一种常用的蛋白质亲和纯化方法,用于从复杂的混合物中富集特定的GST融合蛋白。其原理如下:
构建GST融合蛋白表达质粒:在表达质粒中将GST标签序列与目标蛋白的编码序列相连,通常采用重组DNA技术构建。
转化宿主细胞并表达融合蛋白:将GST融合蛋白表达质粒转化至适宜的宿主细胞,例如大肠杆菌。通过诱导表达系统 (如IPTG诱导) 促使宿主细胞产生GST融合蛋白。
细胞破碎和溶解:收获表达GST融合蛋白的细胞,破碎细胞膜以释放蛋白质,并进行细胞裂解和溶解操作。这样可以使GST融合蛋白与其他细胞组分分离。
与谷胱甘肽GSH结合:将由宿主细胞产生的GST融合蛋白与带有谷胱甘肽结合位点的亲和树脂进行反应。这时,GST标签可以与谷胱甘肽结合,形成稳定的复合物。
洗脱杂质:通过洗涤的步骤去除非特异性结合的污染物,使得只有GST融合蛋白与亲和树脂稳定结合。
蛋白质洗脱:使用含有高浓度谷胱甘肽的缓冲液来洗脱GST融合蛋白,将其从亲和树脂上解离。
通过GST融合蛋白沉降技术,我们可以利用GST标签的亲和性和可逆结合特性,快速纯化目标蛋白,同时避免对目标蛋白原生构象的不可逆破坏。该技术在蛋白质亲和纯化、亚细胞定位以及蛋白-蛋白相互作用研究等领域具有广泛的应用。
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