如题所述
一般有10的7次方单个核细胞
小鼠单个核细胞的分离
基本方案:
从脾脏、胸腺和淋巴结制备细胞悬液
实验材料:
1. RPMI-5或DMEM-5完全培养基
2. 新鲜分离的小鼠器官:≤6周龄的小鼠胸腺;6周至6个月龄的小鼠脾脏和淋巴结
3. 60mm×15mm培养皿
4. 剪刀和镊子(保存在70%乙醇的烧杯中)
5. 装有19G针头的6ml注射器
6. 200μm尼龙滤网
实验方法:
1. 将新鲜分离的器官放入盛有3ml RPMI-5或DMEM-5完全培养基的60mm×15mm培养皿(每种器官一个培养皿)中,用剪刀将器官剪碎。
2. 用6ml注射器的活塞将组织块向培养皿底面用力挤压直至仅剩纤维组织。
3. 用装有19G针头的6ml注射器将组织悬液反复抽吸数次,以进一步粉碎组织团块。
4. 将细胞悬液通过200μm尼龙滤网滤入离心管中。用约4ml完全培养基洗一次培养皿,如需要则重复一次,之后将洗液通过滤网加入离心管中。
5. 在Sorvall H-1000B离心机中以1000r/min(200g)离心10min后弃上清(如需要去除红细胞和死细胞,见辅助方案)。用20ml完全培养基将沉淀重悬后离心,再以适量培养基重悬以便计数。
6. 如细胞不能立即处理,最好的保存细胞活力的方法是将细胞悬液置于冰块中。这种处理也能减少因细胞贴壁引起的细胞损失。
附录:
RPMI-5完全培养基:
RPMI1640培养基(Life Technologies)含有:
5%FBS,56℃热灭活1h
10mmol/L HEPES
20μg/ml硫酸庆大霉素
50μmol/L 2-ME
过滤除菌
小鼠单个核细胞的分离
基本方案:
从脾脏、胸腺和淋巴结制备细胞悬液
实验材料:
1. RPMI-5或DMEM-5完全培养基
2. 新鲜分离的小鼠器官:≤6周龄的小鼠胸腺;6周至6个月龄的小鼠脾脏和淋巴结
3. 60mm×15mm培养皿
4. 剪刀和镊子(保存在70%乙醇的烧杯中)
5. 装有19G针头的6ml注射器
6. 200μm尼龙滤网
实验方法:
1. 将新鲜分离的器官放入盛有3ml RPMI-5或DMEM-5完全培养基的60mm×15mm培养皿(每种器官一个培养皿)中,用剪刀将器官剪碎。
2. 用6ml注射器的活塞将组织块向培养皿底面用力挤压直至仅剩纤维组织。
3. 用装有19G针头的6ml注射器将组织悬液反复抽吸数次,以进一步粉碎组织团块。
4. 将细胞悬液通过200μm尼龙滤网滤入离心管中。用约4ml完全培养基洗一次培养皿,如需要则重复一次,之后将洗液通过滤网加入离心管中。
5. 在Sorvall H-1000B离心机中以1000r/min(200g)离心10min后弃上清(如需要去除红细胞和死细胞,见辅助方案)。用20ml完全培养基将沉淀重悬后离心,再以适量培养基重悬以便计数。
6. 如细胞不能立即处理,最好的保存细胞活力的方法是将细胞悬液置于冰块中。这种处理也能减少因细胞贴壁引起的细胞损失。
附录:
RPMI-5完全培养基:
RPMI1640培养基(Life Technologies)含有:
5%FBS,56℃热灭活1h
10mmol/L HEPES
20μg/ml硫酸庆大霉素
50μmol/L 2-ME
过滤除菌
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