如题所述
腺苷酸环化酶，一种分布于细胞质膜、核膜和内质网膜上的酶，其功能是催化ATP转化为3'，5'－环磷酸腺苷（cAMP），并释放焦磷酸。早期，Howell等人（1972）通过使用亚胺二磷酸腺苷（AMP－PNP）作为底物，首次定位了动物细胞中的腺苷酸环化酶。在实验中，未固定和固定的组织中，ATP－PNP是腺苷酸环化酶的特异性底物，它在酶的作用下生成cAMP和PNP，PNP能与铅离子结合形成高电子密度的不溶性产物。然而，铅对酶活性有抑制作用，Fujimoto等人（1981）通过使用二钾亚砜（DMSO）的硝酸铅法来解决这个问题。
固定步骤中，推荐使用含有0.1M pH 7.4的二甲胂酸钠缓冲液，其中包含8%的蔗糖和5%的DMSO。固定液由2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合而成，但过高的戊二醛浓度可能导致酶活性丧失。在肝脏等组织中，添加5% DMSO可有效保存酶活性。固定时间通常在0～4℃下进行2小时或室温下1小时。
洗涤阶段，用缓冲液漂洗1小时至过夜，更换缓冲液多次；接着进行厚切片。孵育过程的配方和条件见相关表格（\ref{table:Enzyme-7}），其中AMP－PNP是特异性底物，需注意室温下或冷冻保存时，AMP－PNP等化合物的变化。左旋咪唑用于抑制碱性磷酸酶活性，氟化钠作为激活剂，需根据组织特性加入孵育液。
在后固定步骤中，需使用不含DMSO的缓冲液彻底洗涤，以排除残留的DMSO影响。锇酸后固定时，对酶反应产物有影响，通常建议控制在5分钟内，以防产物颗粒变粗或完全溶解。对照实验中，可以通过去除底物AMP－PNP或加入四氧嘧啶来调整。
最后，DMSO的硝酸铅法孵育液配方包括Tris－顺丁烯二酸缓冲液（pH 7.4）、8%的蔗糖、氟化钠、茶碱、0.5mM的AMP－PNP、硫酸镁、2.5mM的左旋咪唑、5%的DMSO（体积比）和2.0mM的硝酸铅，孵育温度保持在37℃，pH为7.4。
固定步骤中，推荐使用含有0.1M pH 7.4的二甲胂酸钠缓冲液，其中包含8%的蔗糖和5%的DMSO。固定液由2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合而成，但过高的戊二醛浓度可能导致酶活性丧失。在肝脏等组织中，添加5% DMSO可有效保存酶活性。固定时间通常在0～4℃下进行2小时或室温下1小时。
洗涤阶段，用缓冲液漂洗1小时至过夜，更换缓冲液多次；接着进行厚切片。孵育过程的配方和条件见相关表格（\ref{table:Enzyme-7}），其中AMP－PNP是特异性底物，需注意室温下或冷冻保存时，AMP－PNP等化合物的变化。左旋咪唑用于抑制碱性磷酸酶活性，氟化钠作为激活剂，需根据组织特性加入孵育液。
在后固定步骤中，需使用不含DMSO的缓冲液彻底洗涤，以排除残留的DMSO影响。锇酸后固定时，对酶反应产物有影响，通常建议控制在5分钟内，以防产物颗粒变粗或完全溶解。对照实验中，可以通过去除底物AMP－PNP或加入四氧嘧啶来调整。
最后，DMSO的硝酸铅法孵育液配方包括Tris－顺丁烯二酸缓冲液（pH 7.4）、8%的蔗糖、氟化钠、茶碱、0.5mM的AMP－PNP、硫酸镁、2.5mM的左旋咪唑、5%的DMSO（体积比）和2.0mM的硝酸铅，孵育温度保持在37℃，pH为7.4。
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