如题所述
举例一：BD流式细胞仪FACSCalibur试剂选择及常见问题解答
一、如何搭配流式抗体荧光标记
1. BD流式细胞仪通道的搭配取决于激光的数量和功能。例如，标配的FACSCalibur只有一根488nm激光，能检测FL1、FL2、FL3三个荧光通道。而选配的Calibur配有488nm和635nm两根激光，可以检测FL1-FL4四个通道。
2. 荧光标记抗体搭配原则有两个：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以自由搭配，但要注意避免同一荧光素在不同通道上的重复使用。
3. 当检测指标超过流式细胞仪的通道数时，应将指标分为两组，分别检测。例如，同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，可将样本分为两份，第一份检测CD3、CD4、CD8和IL-4，第二份检测CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。
二、同型对照（Isotypy Control）
1. 同型对照的作用是消除由于抗体非特异性与细胞结合产生的背景染色，它是一种真正的阴性对照，可用于设定流式细胞仪的电压，并帮助省略昂贵和繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。
2. 同型对照的选择应与一抗的来源、亚型、亚链、荧光标记完全相同。例如，抗人CD56 APC标记的抗体，其同型对照应为APC标记的Mouse IgG1,κ。
3. 若找不到完全相同的同型对照，可选择亚链、亚型、免疫球蛋白类别相同的对照。例如，抗人IgG2a,κ抗体，同型对照选择顺序为：亚链不同－亚型不同－相同类别。
4. 同型对照在BD目录或网站上与对应抗体位置一致。人的抗体同型对照位于HUMAN章节后，小鼠的位于MOUSE章节后，非人类灵长类的位于NON HUMAN PRIMATE章节后。
5. 需要使用同型对照的客户包括：不熟悉流式的客户、做胞内流式的客户、使用不常见标志或特异性不高的标志的客户、对流式熟悉且使用常用表面标志的客户可不使用同型对照。
6. 同型对照表达高于抗体可能是因为同型对照抗体加错类型、剂量等，或标志在细胞表面或胞内表达不高，同型对照的非特异性结合超过抗体的特异性。这种情况下，推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。
三、补偿微球
流式细胞仪的荧光补偿需要定期调整以适应实验条件。不当的补偿可能导致细胞分群不明显或结果图不准确。补偿微球（BD CompBeads）是一种用于多色分析和复合荧光素补偿调节的微球，它不携带任何荧光，通过与客户自己的特异性荧光抗体结合来调节补偿。使用补偿微球可以简化补偿调节过程，提高灵敏度和一致性，适用于多色分析，特别是五色、六色、七色等复合荧光素分析。使用补偿微球后，流式条件可保存，方便下次参考。
一、如何搭配流式抗体荧光标记
1. BD流式细胞仪通道的搭配取决于激光的数量和功能。例如，标配的FACSCalibur只有一根488nm激光，能检测FL1、FL2、FL3三个荧光通道。而选配的Calibur配有488nm和635nm两根激光，可以检测FL1-FL4四个通道。
2. 荧光标记抗体搭配原则有两个：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以自由搭配，但要注意避免同一荧光素在不同通道上的重复使用。
3. 当检测指标超过流式细胞仪的通道数时，应将指标分为两组，分别检测。例如，同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，可将样本分为两份，第一份检测CD3、CD4、CD8和IL-4，第二份检测CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。
二、同型对照（Isotypy Control）
1. 同型对照的作用是消除由于抗体非特异性与细胞结合产生的背景染色，它是一种真正的阴性对照，可用于设定流式细胞仪的电压，并帮助省略昂贵和繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。
2. 同型对照的选择应与一抗的来源、亚型、亚链、荧光标记完全相同。例如，抗人CD56 APC标记的抗体，其同型对照应为APC标记的Mouse IgG1,κ。
3. 若找不到完全相同的同型对照，可选择亚链、亚型、免疫球蛋白类别相同的对照。例如，抗人IgG2a,κ抗体，同型对照选择顺序为：亚链不同－亚型不同－相同类别。
4. 同型对照在BD目录或网站上与对应抗体位置一致。人的抗体同型对照位于HUMAN章节后，小鼠的位于MOUSE章节后，非人类灵长类的位于NON HUMAN PRIMATE章节后。
5. 需要使用同型对照的客户包括：不熟悉流式的客户、做胞内流式的客户、使用不常见标志或特异性不高的标志的客户、对流式熟悉且使用常用表面标志的客户可不使用同型对照。
6. 同型对照表达高于抗体可能是因为同型对照抗体加错类型、剂量等，或标志在细胞表面或胞内表达不高，同型对照的非特异性结合超过抗体的特异性。这种情况下，推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。
三、补偿微球
流式细胞仪的荧光补偿需要定期调整以适应实验条件。不当的补偿可能导致细胞分群不明显或结果图不准确。补偿微球（BD CompBeads）是一种用于多色分析和复合荧光素补偿调节的微球，它不携带任何荧光，通过与客户自己的特异性荧光抗体结合来调节补偿。使用补偿微球可以简化补偿调节过程，提高灵敏度和一致性，适用于多色分析，特别是五色、六色、七色等复合荧光素分析。使用补偿微球后，流式条件可保存，方便下次参考。
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