如题所述
0引言
脆性X综合征(fragile X syndrome, FXS)是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征,有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1(fragile X mental retardation, FMR1)中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致. FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生[1-2]. 本实验对编码基因存在于3号染色体[3],能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达,并对其DNA结合活性进行研究.
1材料和方法
1.1材料
大肠杆菌DH5α, BL21( DE3)和表达载体pRSET A均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自Sigma公司; 限制性内切酶BamH I和KpnI购自宝生物工程公司;T4 DNA连接酶购自Promega公司; Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司;链酶亲和素磁珠购自Dynal公司;低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司.
1.2方法
1.2.1表达载体的构建
根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物:CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA,CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG. 其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板,扩增编码CGGBP1的基因序列. 设计PCR扩增体系25 μL,灭菌去离子水10 μL,10×反应缓冲液2.5 μL,25 mmol/L MgCl2 2.0 μL,DMSO 2.5 μL,4× dNTP混合物(每种2.5 mmol/L)2 μL,CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol,模板3.5 μL(50 ng/μL), Taq DNA(5 μ/μL)聚合酶0.5 μL. 扩增条件:95℃预变性5 min,再94℃ 30 s, 53℃ 1 min,72℃ 1 min循环40次,最后72℃终末延伸产物10 min. PCR产物经琼脂糖电泳分离,用胶回试剂盒回收目的基因. 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A,酶切产物电泳后回收,在T4连接酶作用下,目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α,接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落.
1.2.2融合蛋白的诱导表达
将测序正确的重组质粒转入BL21( DE3). 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中, 37℃振荡培养12 h, 按10 mL/L比例转接于新鲜培养基,37℃振荡培养至对数生长期时,加入IPTG至终浓度1 mmol/L,32℃诱导振荡培养4 h,离心收集菌体,SDSPAGE分析重组蛋白的表达.
1.2.3蛋白表达形式的分析
取5 mL菌液离心,用500 μL的裂解液(10 mmol/L 咪唑,300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH 8.0)重悬,加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL,冰浴30 min,超声波裂菌,离心后分别将上清和沉淀进行SDSPAGE分析.
1.2.4融合蛋白的纯化
将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min,直接过柱. 过柱结束后,用4 mL漂洗液(20 mmol/L 咪唑,300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0),洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用0.5 mL洗脱液(250 mmol/L 咪唑,300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0) 3次洗脱特异结合的目的蛋白,分步收集. 取收集液,进行SDSPAGE分析.
1.2.5CGGBP1与(CGG)29重复序列双链DNA结合
实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次,除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液(10 mmol/L TrisHCl,2 mol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1 g/L Tween 20)15 μL重悬磁珠,各5 μL分3组实验. 其中一组加入25 μL(100 ng/μL)生物素化的(CGG)29重复序列双链DNA,另外两组分别加入25 μL(100 ng/μL)非生物素化的(CGG)29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照;三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL,25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后,弃上清. 重复上述步骤3次;加入纯化后CGGBP1(500 μg/mL)15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液(20 mmol/L HEPES,100 mmol/L NaCl,0.5 mmol/L DTT,100 g/L甘油)20 μL,室温下静置30 min;经磁力吸附后,弃上清;用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次;加三蒸水10 μL,沸水煮10 min,进行SDSPAGE分析.
2结果
2.1原核表达载体的构建及鉴定
扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳,可观察到一条约504 bp的条带(图1); 重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A分别用BamHI和KpnI酶切,pRSET A/CGGBP1分为两个片段,分别为2.9 ku和504 bp(图2),均与预计结果相同.
2.2CGGBP1的表达
用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒,筛选阳性重组质粒. 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的E.coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后,在Mr 约25 000处出现1条表达条带;而未经IPTG诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解,离心后分为上清和沉淀两部分. 经SDSPAGE分析表明,CGGBP1部分存在于细菌裂解液的上清中,为可溶性蛋白,上清液中的目标蛋白相对较少(图3).
2.3CGGBP1蛋白纯化
在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游, 插入有连续6个组氨酸的序列 —(His )6 tag. 重组质粒经诱导表达后,(His )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法,是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. SDSPAGE显示,CGGBP1得到较高程度的纯化(图4).
2.4CGGBP1与5′d(CGG)293′重复序列
双链DNA结合实验生物素化的5′d(CGG)29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上,非生物素化的5′d(CGG)293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理,加入CGGBP1后,未和5′d (CGG)293′重复序列双链DNA结合的蛋白也被洗脱(图5).
3讨论
关于微卫星的产生机制,普遍认为是DNA复制过程中DNA聚合酶的滑动[4],或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配,导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列,通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域,这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体RNA基因中非常复杂,同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合,成为“染色质折叠密码”[5-6],参与遗传物质的结构改变,基因调控及细胞分化等过程. 脆性X综合征是Igarashi等[7]研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和(CGG)n重复序列发生特异性结合,而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合[8]. 因此,对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义.
本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒,以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过Ni2+NTA柱纯化,获得纯化的目标融合蛋白质,同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.
脆性X综合征(fragile X syndrome, FXS)是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征,有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1(fragile X mental retardation, FMR1)中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致. FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生[1-2]. 本实验对编码基因存在于3号染色体[3],能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达,并对其DNA结合活性进行研究.
1材料和方法
1.1材料
大肠杆菌DH5α, BL21( DE3)和表达载体pRSET A均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自Sigma公司; 限制性内切酶BamH I和KpnI购自宝生物工程公司;T4 DNA连接酶购自Promega公司; Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司;链酶亲和素磁珠购自Dynal公司;低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司.
1.2方法
1.2.1表达载体的构建
根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物:CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA,CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG. 其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板,扩增编码CGGBP1的基因序列. 设计PCR扩增体系25 μL,灭菌去离子水10 μL,10×反应缓冲液2.5 μL,25 mmol/L MgCl2 2.0 μL,DMSO 2.5 μL,4× dNTP混合物(每种2.5 mmol/L)2 μL,CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol,模板3.5 μL(50 ng/μL), Taq DNA(5 μ/μL)聚合酶0.5 μL. 扩增条件:95℃预变性5 min,再94℃ 30 s, 53℃ 1 min,72℃ 1 min循环40次,最后72℃终末延伸产物10 min. PCR产物经琼脂糖电泳分离,用胶回试剂盒回收目的基因. 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A,酶切产物电泳后回收,在T4连接酶作用下,目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α,接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落.
1.2.2融合蛋白的诱导表达
将测序正确的重组质粒转入BL21( DE3). 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中, 37℃振荡培养12 h, 按10 mL/L比例转接于新鲜培养基,37℃振荡培养至对数生长期时,加入IPTG至终浓度1 mmol/L,32℃诱导振荡培养4 h,离心收集菌体,SDSPAGE分析重组蛋白的表达.
1.2.3蛋白表达形式的分析
取5 mL菌液离心,用500 μL的裂解液(10 mmol/L 咪唑,300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH 8.0)重悬,加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL,冰浴30 min,超声波裂菌,离心后分别将上清和沉淀进行SDSPAGE分析.
1.2.4融合蛋白的纯化
将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min,直接过柱. 过柱结束后,用4 mL漂洗液(20 mmol/L 咪唑,300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0),洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用0.5 mL洗脱液(250 mmol/L 咪唑,300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0) 3次洗脱特异结合的目的蛋白,分步收集. 取收集液,进行SDSPAGE分析.
1.2.5CGGBP1与(CGG)29重复序列双链DNA结合
实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次,除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液(10 mmol/L TrisHCl,2 mol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1 g/L Tween 20)15 μL重悬磁珠,各5 μL分3组实验. 其中一组加入25 μL(100 ng/μL)生物素化的(CGG)29重复序列双链DNA,另外两组分别加入25 μL(100 ng/μL)非生物素化的(CGG)29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照;三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL,25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后,弃上清. 重复上述步骤3次;加入纯化后CGGBP1(500 μg/mL)15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液(20 mmol/L HEPES,100 mmol/L NaCl,0.5 mmol/L DTT,100 g/L甘油)20 μL,室温下静置30 min;经磁力吸附后,弃上清;用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次;加三蒸水10 μL,沸水煮10 min,进行SDSPAGE分析.
2结果
2.1原核表达载体的构建及鉴定
扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳,可观察到一条约504 bp的条带(图1); 重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A分别用BamHI和KpnI酶切,pRSET A/CGGBP1分为两个片段,分别为2.9 ku和504 bp(图2),均与预计结果相同.
2.2CGGBP1的表达
用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒,筛选阳性重组质粒. 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的E.coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后,在Mr 约25 000处出现1条表达条带;而未经IPTG诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解,离心后分为上清和沉淀两部分. 经SDSPAGE分析表明,CGGBP1部分存在于细菌裂解液的上清中,为可溶性蛋白,上清液中的目标蛋白相对较少(图3).
2.3CGGBP1蛋白纯化
在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游, 插入有连续6个组氨酸的序列 —(His )6 tag. 重组质粒经诱导表达后,(His )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法,是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. SDSPAGE显示,CGGBP1得到较高程度的纯化(图4).
2.4CGGBP1与5′d(CGG)293′重复序列
双链DNA结合实验生物素化的5′d(CGG)29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上,非生物素化的5′d(CGG)293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理,加入CGGBP1后,未和5′d (CGG)293′重复序列双链DNA结合的蛋白也被洗脱(图5).
3讨论
关于微卫星的产生机制,普遍认为是DNA复制过程中DNA聚合酶的滑动[4],或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配,导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列,通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域,这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体RNA基因中非常复杂,同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合,成为“染色质折叠密码”[5-6],参与遗传物质的结构改变,基因调控及细胞分化等过程. 脆性X综合征是Igarashi等[7]研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和(CGG)n重复序列发生特异性结合,而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合[8]. 因此,对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义.
本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒,以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过Ni2+NTA柱纯化,获得纯化的目标融合蛋白质,同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.
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