如题所述
第1个回答 2016-12-21
基本简介
融合蛋白有两种不同的含义,一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。另一种含义就是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白,如在仙台病毒脂双层外侧小叶中含有的两种糖蛋白之一,介导病毒被膜与宿主细胞质膜的融合作用。另一种糖蛋白是血细胞凝集素神经酰胺酶。
两个不同的蛋白质连成一个大分子。可以通过化学方法连接,也可通过基因的融合来实现。在基因操作中,对一些分子数小的多肽基因常采用融合的方法与某一基因(如lac)相连,二者之间接上某一酶(如凝血酶)的切口,以增加在体内表达后产物的稳定性,也有的故意使两个分子串连融合以提高疗效,如IL-3与GM-CSF。也有与分泌性蛋白的信号肽基因组成融合基因,以使表达产物分泌到膜外或胞外。
在基因工程迅速发展的基础上,有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起,进而表达所需蛋白,这种通过在人工条件下将两个或多个基因的编码区首尾连接,由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白。
折叠编辑本段相关技术
折叠技术特点
融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。原核表达系统的特点是时程短,费用低,是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰;大量蛋 白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物,需要复杂的变性和复性过程;大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多,甚至可被改造成人源型;真核细胞易被转染,具有遗传稳定性和可重复性;产物可被分泌,提纯简单,成本低。
折叠技术内容
1.进行目的基因的克隆:根据基因序列互补原则 ,设计合适的引物序列,以cDNA为模板,利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。
2.在载体中进行重组:通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收,然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接,并克隆到高表达质粒载体中,构建重组质粒。
3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。
4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化 。
折叠技术关键
在构建融合蛋白中,一个关键的问题是两蛋白间的接头序列,即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短,可能影响两蛋白高级结构的折叠,从而相互干扰;如果接头序列太长,又涉及免疫原性的问题,因为接头序列本身就是新的抗原。
一般来说,3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。 有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链,如(Gly4Ser1),目的是将两者分开,以缓解相互干扰作用, 并获得了满意的结果。 但具体涉及到每种蛋白时,需具体分析。当我们构建融合蛋白时,应多选择几种融合方式, 从中优化出理想的连接方式。另外,大量研究表明连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。遗憾的是,目前对于连接肽序列的设计还没有可靠的选择标准。现在,大多数连接肽序列的设计和选择仍主要依赖于直觉。尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产生了重大的进步,但是我们对于序列和结构之间的关系的了解还是很有限的。
折叠编辑本段临床应用
折叠DNA疫苗
目前,疫苗已经经历了三代:第一代疫苗是用减毒或杀死的病原体来激活机体免疫系统;第二代疫苗是用生物技术和重组DNA技术研制的组分疫苗注射机体诱导免疫应答; 第三代疫苗是直接注射基因重组的抗原基 因来激活人体免疫系统,即DNA疫苗。DNA疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势,如易于生产,稳定性强,成本低廉等,并可同时诱导体液与细胞免疫应答。
目前利用基因工程成功制成的多价重组抗体融合蛋白 CYF196(国内尚未上市)就是一种DNA疫苗, 它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因为CYF196对病毒的主要受体-位于呼吸道上皮中的细胞间黏附分子有高度亲和力,对鼻病毒感染有较强的防御功能。
折叠双功能酶(多功能酶)
以往研究发现 , 在利用基因融合所构建的大的酶分子中,如果用以构成融合蛋白的各个酶分子的整个编码序列均保留于新的酶分子中,则融合蛋白一般均保留所构成的酶分子各自的酶活性。并且发现在这些新构建的融合蛋白中,蛋白的正确折叠以及各个酶的活性部位均未受到影响,与单个酶相比,融合蛋白的酶的比活力为50%-100%,对于催化连续反应的两种或几种酶, 利用基因融合的方法构成的融合蛋白可产生“ 邻近效应”。
目前研究发现, β-半乳糖苷酶-半乳糖脱氢酶融合蛋白在一定条件下,其偶联反应产生 NADH 的速度是同时加入这两种酶的反应速度的两倍以上。同时过渡态时间缩短近四倍。
折叠定向药物
定向药物一般由两部分组成:一部分是药物;另一部分是可以与病灶特异性结合的配基。通过融合蛋白技术将这两部分融合在一起, 即可构成一个具有独特构象与功能的蛋白质。
折叠编辑本段常见种类
折叠免疫球蛋白(Ig)融合蛋白
免疫球蛋白融合蛋白是指在基因水平将目的基因同Ig部分片段基因相连,并在真核或原核细胞中表达出的具有上述两部分结构域的重组蛋白。据目的蛋白与Ig不同片断相连,可将其分为二大类 :一类为Fab(Fv)融合蛋白; 另一类为 Fc融合蛋白。
折叠甲状旁腺激素(PTH)融合蛋白
甲状旁腺激素是由甲状旁腺主细胞合成和分泌的一种单链多肽激素,成熟PTH含84个氨基酸残基, 分子量约为 9500,是人体内调节钙磷代谢及骨转换的最为重要的激素之一。它主要通过作用于靶细胞膜上腺苷酸环化酶系统, 增加胞浆内cAMP及焦磷酸盐 (PPi) 的水平来发挥作用。
折叠细胞因子重组融合蛋白
细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物。其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合,各组分可发挥协同作用,使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。本回答被网友采纳
融合蛋白有两种不同的含义,一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。另一种含义就是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白,如在仙台病毒脂双层外侧小叶中含有的两种糖蛋白之一,介导病毒被膜与宿主细胞质膜的融合作用。另一种糖蛋白是血细胞凝集素神经酰胺酶。
两个不同的蛋白质连成一个大分子。可以通过化学方法连接,也可通过基因的融合来实现。在基因操作中,对一些分子数小的多肽基因常采用融合的方法与某一基因(如lac)相连,二者之间接上某一酶(如凝血酶)的切口,以增加在体内表达后产物的稳定性,也有的故意使两个分子串连融合以提高疗效,如IL-3与GM-CSF。也有与分泌性蛋白的信号肽基因组成融合基因,以使表达产物分泌到膜外或胞外。
在基因工程迅速发展的基础上,有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起,进而表达所需蛋白,这种通过在人工条件下将两个或多个基因的编码区首尾连接,由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白。
折叠编辑本段相关技术
折叠技术特点
融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。原核表达系统的特点是时程短,费用低,是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰;大量蛋 白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物,需要复杂的变性和复性过程;大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多,甚至可被改造成人源型;真核细胞易被转染,具有遗传稳定性和可重复性;产物可被分泌,提纯简单,成本低。
折叠技术内容
1.进行目的基因的克隆:根据基因序列互补原则 ,设计合适的引物序列,以cDNA为模板,利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。
2.在载体中进行重组:通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收,然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接,并克隆到高表达质粒载体中,构建重组质粒。
3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。
4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化 。
折叠技术关键
在构建融合蛋白中,一个关键的问题是两蛋白间的接头序列,即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短,可能影响两蛋白高级结构的折叠,从而相互干扰;如果接头序列太长,又涉及免疫原性的问题,因为接头序列本身就是新的抗原。
一般来说,3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。 有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链,如(Gly4Ser1),目的是将两者分开,以缓解相互干扰作用, 并获得了满意的结果。 但具体涉及到每种蛋白时,需具体分析。当我们构建融合蛋白时,应多选择几种融合方式, 从中优化出理想的连接方式。另外,大量研究表明连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。遗憾的是,目前对于连接肽序列的设计还没有可靠的选择标准。现在,大多数连接肽序列的设计和选择仍主要依赖于直觉。尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产生了重大的进步,但是我们对于序列和结构之间的关系的了解还是很有限的。
折叠编辑本段临床应用
折叠DNA疫苗
目前,疫苗已经经历了三代:第一代疫苗是用减毒或杀死的病原体来激活机体免疫系统;第二代疫苗是用生物技术和重组DNA技术研制的组分疫苗注射机体诱导免疫应答; 第三代疫苗是直接注射基因重组的抗原基 因来激活人体免疫系统,即DNA疫苗。DNA疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势,如易于生产,稳定性强,成本低廉等,并可同时诱导体液与细胞免疫应答。
目前利用基因工程成功制成的多价重组抗体融合蛋白 CYF196(国内尚未上市)就是一种DNA疫苗, 它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因为CYF196对病毒的主要受体-位于呼吸道上皮中的细胞间黏附分子有高度亲和力,对鼻病毒感染有较强的防御功能。
折叠双功能酶(多功能酶)
以往研究发现 , 在利用基因融合所构建的大的酶分子中,如果用以构成融合蛋白的各个酶分子的整个编码序列均保留于新的酶分子中,则融合蛋白一般均保留所构成的酶分子各自的酶活性。并且发现在这些新构建的融合蛋白中,蛋白的正确折叠以及各个酶的活性部位均未受到影响,与单个酶相比,融合蛋白的酶的比活力为50%-100%,对于催化连续反应的两种或几种酶, 利用基因融合的方法构成的融合蛋白可产生“ 邻近效应”。
目前研究发现, β-半乳糖苷酶-半乳糖脱氢酶融合蛋白在一定条件下,其偶联反应产生 NADH 的速度是同时加入这两种酶的反应速度的两倍以上。同时过渡态时间缩短近四倍。
折叠定向药物
定向药物一般由两部分组成:一部分是药物;另一部分是可以与病灶特异性结合的配基。通过融合蛋白技术将这两部分融合在一起, 即可构成一个具有独特构象与功能的蛋白质。
折叠编辑本段常见种类
折叠免疫球蛋白(Ig)融合蛋白
免疫球蛋白融合蛋白是指在基因水平将目的基因同Ig部分片段基因相连,并在真核或原核细胞中表达出的具有上述两部分结构域的重组蛋白。据目的蛋白与Ig不同片断相连,可将其分为二大类 :一类为Fab(Fv)融合蛋白; 另一类为 Fc融合蛋白。
折叠甲状旁腺激素(PTH)融合蛋白
甲状旁腺激素是由甲状旁腺主细胞合成和分泌的一种单链多肽激素,成熟PTH含84个氨基酸残基, 分子量约为 9500,是人体内调节钙磷代谢及骨转换的最为重要的激素之一。它主要通过作用于靶细胞膜上腺苷酸环化酶系统, 增加胞浆内cAMP及焦磷酸盐 (PPi) 的水平来发挥作用。
折叠细胞因子重组融合蛋白
细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物。其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合,各组分可发挥协同作用,使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。本回答被网友采纳