rna提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些

细胞中的rna主要有三类：rrna约占80％－85％，trna和核内小分子rna约占10%-15%，mrna约占1%-5%，由于rrna占绝大多数，因此我们用琼脂糖凝胶电泳可以看到的即是rrna，它也有三种类型：28s，18s，5s。所以我们看到的也应该是三条带，而且28s的亮度为18s的两倍。这样的rna才可以用来建库。
在rna的提取时，一定要注意rnase的污染，因rna极易被rnase的降解，操作时应尽量少说话，并在洁净的环境中操作，主要防止手、唾液和空气中rnase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%depc溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无rnase,，可以不经处理直接用于提取rna，实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有rnase污染，使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品），另外，由于材料不同，机体内含有的糖、酚类物质不一样，因此材料不同用的方法也应该不一样。
下面是两种提取方法，第一种适用于嫩组织或动物组织的总rna的提取，第二种适用于老组织的提取。
试剂：提取缓冲液，kac(5m),
异丙醇，无水乙醇，depc水
仪器：离心机，恒温水浴锅，研钵
方法一
动物、植物（嫩叶）的总rna分离
大约2克植物组织或动物组织用液氮研磨
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加5mltrizol裂解液
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12000rpm
，4度，10分钟
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加入1ml氯仿
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剧烈振荡15秒，室温温育2-3分钟
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室温离心10分钟，8000rpm
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取上清，加入等体积的异丙醇，15-30度放置10分钟。
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12000g离心10分钟
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弃上清，加入10ml75%洒精洗沉淀。
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2-8度下，不超过7500g离心5分钟
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弃上清，干燥沉淀10分钟
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用depc水溶。
方法二
、植物老叶、老根或多糖含量高的材料的总rna分离
1g组织液氮研磨，加入6ml提取缓冲液
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2min振荡
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65℃，20min
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加入1.5mlkac
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混匀，冰浴20min
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8000rpm,4℃,15min
取上清，加入0.6倍异丙醇，-20℃，1小时（或室温15-20min）
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12000rpm,4℃,15min
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75%乙醇，12000rpm,20℃,5min
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晾干，溶60uldepc水，15min
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12000rpm,4℃,5min,
上清即为rna。