如题所述
使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白,是我们大家再熟悉不过的实验操作了.我们对整个操作的流程及注意事项,很可能是师从兄师姐那里获得的.这 些经验都是大家智慧的结晶.同时,这也有一定的不足之处,那就是我们学习到的是局部,还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿,那些知识我们应该从哪 里掌握呢?
给大家推荐一个办法,那就是参考那些大公司的实验手册.一般像GE、Qiagen等知名公司,都有Ni柱柱材料的产品,因此关于柱材料的各种性质参数,以及使用方法和注意事项都有详细的说明.
下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips,仅供参考.
1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如：NH4,甘氨酸,精氨酸,Tris,等等；
2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂,如EDTA,EGTA,等等；
3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,比如DTT,防止二价Ni被还原；
4. 不能含离子型的去垢剂,比如SDS,防止Ni流失；
5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂,比如0.1-1mM的PMSF,防止目的蛋白被降解；
6. 缓冲液里可以加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀,甘油浓度最高可达50%（v/v）
7. 应避免含碳酸氢钠,柠檬酸等物质；
8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；
9. 可加入变性剂促溶,盐酸胍（最高可6M）,尿素（最高可8M）
10.可加入非离子型去垢剂,如Triton,Tween,NP40等,最高2%,可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染
给大家推荐一个办法,那就是参考那些大公司的实验手册.一般像GE、Qiagen等知名公司,都有Ni柱柱材料的产品,因此关于柱材料的各种性质参数,以及使用方法和注意事项都有详细的说明.
下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips,仅供参考.
1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如：NH4,甘氨酸,精氨酸,Tris,等等；
2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂,如EDTA,EGTA,等等；
3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,比如DTT,防止二价Ni被还原；
4. 不能含离子型的去垢剂,比如SDS,防止Ni流失；
5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂,比如0.1-1mM的PMSF,防止目的蛋白被降解；
6. 缓冲液里可以加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀,甘油浓度最高可达50%（v/v）
7. 应避免含碳酸氢钠,柠檬酸等物质；
8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；
9. 可加入变性剂促溶,盐酸胍（最高可6M）,尿素（最高可8M）
10.可加入非离子型去垢剂,如Triton,Tween,NP40等,最高2%,可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染
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第1个回答 推荐于2016-12-01
使用Ni柱纯化带有His标签的融合蛋白,是我们大家再熟悉不过的实验操作了.我们对整个操作的流程及注意事项,很可能是师从兄师姐那里获得的.这 些经验都是大家智慧的结晶.同时,这也有一定的不足之处,那就是我们学习到的是局部,还有一些我们不常用或者基本不会接触到的面儿,那些知识我们应该从哪 里掌握呢?
给大家推荐一个办法,那就是参考那些大公司的实验手册.一般像GE、Qiagen等知名公司,都有Ni柱柱材料的产品,因此关于柱材料的各种性质参数,以及使用方法和注意事项都有详细的说明.
下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips,仅供参考.
1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如：NH4,甘氨酸,精氨酸,Tris,等等；
2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂,如EDTA,EGTA,等等；
3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,比如DTT,防止二价Ni被还原；
4. 不能含离子型的去垢剂,比如SDS,防止Ni流失；
5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂,比如0.1-1mM的PMSF,防止目的蛋白被降解；
6. 缓冲液里可以加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀,甘油浓度最高可达50%（v/v）
7. 应避免含碳酸氢钠,柠檬酸等物质；
8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；
9. 可加入变性剂促溶,盐酸胍（最高可6M）,尿素（最高可8M）
10.可加入非离子型去垢剂,如Triton,Tween,NP40等,最高2%,可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染本回答被提问者和网友采纳
给大家推荐一个办法,那就是参考那些大公司的实验手册.一般像GE、Qiagen等知名公司,都有Ni柱柱材料的产品,因此关于柱材料的各种性质参数,以及使用方法和注意事项都有详细的说明.
下面我就列举一些我从这些实验手册里总结出来的一部分Tips,仅供参考.
1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团,比如：NH4,甘氨酸,精氨酸,Tris,等等；
2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂,如EDTA,EGTA,等等；
3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂,比如DTT,防止二价Ni被还原；
4. 不能含离子型的去垢剂,比如SDS,防止Ni流失；
5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂,比如0.1-1mM的PMSF,防止目的蛋白被降解；
6. 缓冲液里可以加入甘油,防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀,甘油浓度最高可达50%（v/v）
7. 应避免含碳酸氢钠,柠檬酸等物质；
8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间；
9. 可加入变性剂促溶,盐酸胍（最高可6M）,尿素（最高可8M）
10.可加入非离子型去垢剂,如Triton,Tween,NP40等,最高2%,可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染本回答被提问者和网友采纳
