如题所述
我现在做原核表达一个融合蛋白,其中单链抗体基因是合成的（根据大肠杆菌的密码子偏爱性设计的），表达载体是PET和pGEX，做了几次表达好象蛋白都行成包涵体。
我想请教的问题是：
一 如何判断是不是形成包涵体，我们实验室那个破超声波破碎仪坏了，再没有超声波破碎仪的情况下如何破碎菌体，我配了下面二种裂解液
裂解液的成分：50mMTris-HCl, pH8.0, 2mM EDTA，100mM NaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1%Triton X-100
裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml
再一起用我们那个破破碎仪超但根本打不动，最后我就用反复冻融法把其中二个在（37和-20反复冻融）感觉也不行，
请问大侠们，你们是如何破碎菌体的，反复冻融该怎么搞了？我看别人判断破碎是不是完全的标准是： 1，外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。
这一项是一个比较常用的方法，以前我的师姐也这么告诉我的，但我超一个小时还没有透明？
2，液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。
这一项跟没有看到粘滞性，是不是我破碎时加的液体太多了，大家在超声时加什么缓冲液？比例是多少？
3，高速离心：有用高速离心检测超声破碎程度的（一般用6,000 g 10 min, 比一般离心收集菌体的转速高一点）。 沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。
高速离心检测时6,000 g是不是转速太低了，我们以前都20000g，离心后再跑胶检测？
4，染色：破碎后的菌液涂片，革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟，镜检
染色后看什么样的结果说明破碎完全了？
二 我在做原核表达时，表达载体是PET和pGEX，表达条件是：
诱导温度37度 [IPTG]=0.5mM 时间是3h
表达后检测是包涵体
怎么搞才能使蛋白形成可容性的蛋白？
下面的方法哪个更有效一些：
1 降低表达温度。（20-30度表达）
2 增加诱导时细菌密度。（OD大于1.0）
3 降低表达启动温度。（先将菌株冷至20度左右再诱导）
4 降低诱导剂的浓度。（如IPTG可小于0.1mM）
5 增加通气。（培养瓶中放入1/3左右的培养基，猛烈摇动，增加氧含量，抑制包涵体形成）
6 减少诱导时间。（2-4小时
大家能给推荐一些进口超声破碎仪的资料
我想请教的问题是：
一 如何判断是不是形成包涵体，我们实验室那个破超声波破碎仪坏了，再没有超声波破碎仪的情况下如何破碎菌体，我配了下面二种裂解液
裂解液的成分：50mMTris-HCl, pH8.0, 2mM EDTA，100mM NaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1%Triton X-100
裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml
再一起用我们那个破破碎仪超但根本打不动，最后我就用反复冻融法把其中二个在（37和-20反复冻融）感觉也不行，
请问大侠们，你们是如何破碎菌体的，反复冻融该怎么搞了？我看别人判断破碎是不是完全的标准是： 1，外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。
这一项是一个比较常用的方法，以前我的师姐也这么告诉我的，但我超一个小时还没有透明？
2，液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。
这一项跟没有看到粘滞性，是不是我破碎时加的液体太多了，大家在超声时加什么缓冲液？比例是多少？
3，高速离心：有用高速离心检测超声破碎程度的（一般用6,000 g 10 min, 比一般离心收集菌体的转速高一点）。 沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。
高速离心检测时6,000 g是不是转速太低了，我们以前都20000g，离心后再跑胶检测？
4，染色：破碎后的菌液涂片，革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟，镜检
染色后看什么样的结果说明破碎完全了？
二 我在做原核表达时，表达载体是PET和pGEX，表达条件是：
诱导温度37度 [IPTG]=0.5mM 时间是3h
表达后检测是包涵体
怎么搞才能使蛋白形成可容性的蛋白？
下面的方法哪个更有效一些：
1 降低表达温度。（20-30度表达）
2 增加诱导时细菌密度。（OD大于1.0）
3 降低表达启动温度。（先将菌株冷至20度左右再诱导）
4 降低诱导剂的浓度。（如IPTG可小于0.1mM）
5 增加通气。（培养瓶中放入1/3左右的培养基，猛烈摇动，增加氧含量，抑制包涵体形成）
6 减少诱导时间。（2-4小时
大家能给推荐一些进口超声破碎仪的资料
温馨提示：答案为网友推荐，仅供参考
第1个回答 推荐于2016-12-02
细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方
法有三种：①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。
由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：
①破碎细胞难；从处死动物٠分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA 可能会被DN ase降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝٠肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA 断裂。
②分子量大，一般比细菌的大2—3个数量级，比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。本回答被提问者采纳
法有三种：①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。
由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：
①破碎细胞难；从处死动物٠分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA 可能会被DN ase降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝٠肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA 断裂。
②分子量大，一般比细菌的大2—3个数量级，比病毒的大4—5个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。本回答被提问者采纳
