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原核表达没条带
原核表达没
有目的
条带
!!!
答:
降低IPTG浓度和诱导温度,掌握好诱导时间试试
原核表达
常见问题(三)蛋白纯化后续的问题分析
答:
3. 标签没有表达出来:1.
可能是因为折叠构象不正确导致标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的表面上无法与离子柱结合
。2. 标签在折叠时没有位于蛋白质分子的表面上。4. 填料有问题,换填料。5. PH、离子强度是否合适,平衡缓冲液是否应与样品缓冲液 pH、离子强度相同。1. 蛋白质的折叠形态发生了改变...
关于
原核表达
问题
答:
OD600只能看出菌体浓度,一般超过1.0才够,我们的经验是500ml的菌液在锥形瓶里摇到发白,手掌放在瓶底下从上面看不清手指了,就OK了,但关键还是要看你的目的蛋白浓度,
条带
会变成很明显的一大团。诱导的起始浓度是要测定的,一般都是1.0,诱导时间是取样以后根据诱导蛋白
表达
情况测定的,没有统一安...
原核表达
时跑完电泳,
条带
应该是多大,是和自己的目的基因蛋白的分子量一...
答:
原核表达
的蛋白是没有修饰作用的,一般而言电泳表观分子量应该与蛋白分子量+标签的大小一致。但有时候会有一定的迁移,比如用pet28a表达的蛋白进行电泳时表观分子量会比蛋白分子量+标签大5kD左右。不过通过对比未诱导的阴性对照能很清楚地看出来自己表达的蛋白。
原核表达
出来的蛋白纯化后怎么是三
条带
答:
可能是蛋白发生了降解
,在表达后期、纯化前期需要加入蛋白酶抑制剂。
原核表达
目的
条带
的表达还要算上质粒上的大小吗
答:
质粒的大小是DNA,与
表达
后目的蛋白的大小无直接关系;在算目的蛋白的大小时,要考虑的是有无标签或报告基因,如His-Tag,GST-Tag,GFP等,尤其是GST好GFP,分子量不小,必须考虑.祝好!
问个问题哦,我进行的是
原核
蛋白
表达
,表达载体是PET32a,表达菌液超声...
答:
首先得判断蛋白
条带
是否正确,因为32a表达过程中,会在目标蛋白上加上部分自己序列,所以电泳图谱中你所要表达的蛋白,应该比你自己预期的大20-30kDa。其次,
原核表达
,只是表达了酶蛋白序列,但蛋白序列与酶之间不能划等号,要有一个正确的加工之后形成合适的二、三级结构,蛋白才有活性 ...
载体pet28a构建重组质粒,测序准确,转至BL21
原核表达
蛋白,,怎么也诱导...
答:
1 可能是太弱你看不出来,建议用His抗体做个western 看看是不是有
条带
而看不出。2 是不是融解性太差,建议将你的氨基酸序列做个疏水性分析。如果确实如此的话可能要重新构载体
在做大肠杆菌
原核表达
,验证有目的
条带
,但是大剂量诱导并破碎离心后电...
答:
你这好像不是拖尾,是破碎使得蛋白质破断了,我们这边也有人超声波裂解细胞裂断了,差不多就是这个样子,你最好摸索一个比较好的破碎时间
原核表达
产物纯化后有一条非目的蛋白
条带
,怎么办
答:
如果有抗体,做个western blot判断下,是杂带还是降解片段;如果是杂带,优先考虑优化你使用的纯化方案,如Ni柱,考虑延长washing buffer的时间和提高咪唑浓度,使用分辨率更好的填料;还去不掉,考虑用2步或3步纯化,比如用离子交换、凝胶过滤。个人见解,仅供参考,祝一切愉快!
1
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