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蛋白纯化杂带太多
蛋白
两次
纯化
后
杂带
反而变多,什么原因
答:
很可能是
蛋白
降解,推荐考虑后续实验需求,尝试加一些蛋白酶抑制剂。
pritA
蛋白纯化
有
杂带
咋办
答:
用肝素柱进一步
纯化
。如果结合核酸可以考虑用肝素柱进一步纯化。镍柱纯化的时候不用咪唑梯度浓度洗杂,一般用低浓度(10 mM)的溶液洗就可以了,如果有chaperone的话可以用高盐洗一下。
原核表达常见问题(三)
蛋白纯化
后续的问题分析
答:
1.目的
蛋白纯化
浓缩之后,目的蛋白条带周围出现
杂带
,据推测可能是插入目的基因后,外源基因的表达刺激大肠杆菌产生了宿主蛋白酶,对异源蛋白进行降解的产物。样品缓冲液有相同的 pH 和离子强度。离子交换纯化是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不一样达到分离目的的一种蛋白纯化分...
纯化蛋白
有
杂带
但是很细
答:
加入低浓度(5-10mM咪唑);上样后,多洗几个柱体积的缓冲液及低浓度咪唑(20-50mM),更多的洗掉
杂蛋白
(请注意,在这个过程也会伴随目标蛋白的缓慢洗脱,会一定程度降低得率,所以需要优化时间和浓度);再采用梯度咪唑洗脱目标蛋白。
我用Amylose FF
纯化
MBP融合
蛋白
时老是结合的目标蛋白很少 纯化出的蛋白...
答:
Amylose的结合载量比较低,另外也要考虑MBP的暴露情况。建议换用GE公司的,标称7mg/ml,实际数值也接近于此。
镍柱
纯化
后
杂带很多
怎么办
答:
你好,
蛋白
保存是个比较棘手的问题,就我的理解来讲: 蛋白的保存很大程度上依赖于蛋白本身的结构稳定性,其次和保存条件优化有关; 尽量避免蛋白的反复冻融,这会对蛋白的结构和活性造成破坏; 像你说到的第二天就要用,根本没必要放在-70℃低温。
做得GST融合
纯化
总有
杂带
如何去掉?
答:
还要注意的问题是超声破碎时注意功率和时间,避免过强时间过长,降解
蛋白
。你可以GST抗体做WB看是不两个都是你要的东西,会不会是降解或造成这样的结果。可以加点酶的抑制剂。 ………更多具体材料请参考:GST标签
纯化
试剂盒: http://product.bio1000.com/100111/ ...
蛋白纯化
问题
答:
可能是表达的问题。在表达你目的蛋白的同时有
很多杂蛋白
被同时表达了。你可以增加前面洗脱的步骤,尽可能多的将杂蛋白洗脱掉。
我将
纯化
的
蛋白
跑电泳,每空加了30ul的蛋白,蛋白浓度为1.3ug/ml,结果...
答:
没有人能把
蛋白纯化
到100%。出现
杂带
不能说明不能用,你需要测定具体的纯度,再做判断。
原核表达产物
纯化
后有一条非目的
蛋白
条带,怎么办
答:
如果有抗体,做个western blot判断下,是
杂带
还是降解片段;如果是杂带,优先考虑优化你使用的
纯化
方案,如Ni柱,考虑延长washing buffer的时间和提高咪唑浓度,使用分辨率更好的填料;还去不掉,考虑用2步或3步纯化,比如用离子交换、凝胶过滤。个人见解,仅供参考,祝一切愉快!
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