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IPTG诱导蛋白表达时间
诱导
式
IPTG的
浓度应该好多?要试验确定吗
答:
一、需要做实验确定,诱导时IPTG的浓度一般情况是1mg/ml,不过有的蛋白有时不需要这么高的浓度。二、可以做一个梯度诱导,一般在菌浓OD600达到0.8-1.0的时候诱导。三、培养两个小时候后,每隔一小时取样,
大约在3-5小时的时候蛋白表达达到最高值
,最后收菌后,加上以前的取得样品跑SDS-PAGE胶检验...
IPTG诱导
BL(DE3)/BL(DE3)plysS
蛋白表达
的最佳温度,
时间
,IPTG的浓度...
答:
一般是将菌摇到OD600=0.4-0.6,然后加入终浓度1mM的
IPTG
(这个一般不变,诱导不出来再考虑适当多加点,例如2-5mM),但是
诱导时间
和诱导温度根据
诱导蛋白
大小、性质的不同而不同,需要摸索的,你可以做个预实验,隔两个小时取样,最后SDS-PAGE,寻找合适诱导时间,如果不想这么麻烦,直接过夜诱导。诱...
用IPTG诱导表达
的
时间
是否越长越好,为什么?
答:
用IPTG诱导表达的时间不是越长越好
,因为只有在特定的环境信号(加入IPTG)刺激下,目的基因才会被激活,之后才会产生大量的代谢表达产物,收集有较多表达量的菌体。如果不用IPTG的话,大部分目的蛋白是不会表达的,有少部分可能会有极少量的表达,称之为泄漏表达。科学研究:IPTG常用于需要诱导β-半乳糖...
大肠杆菌
诱导
后,收集菌体,用水洗的时候变成黏糊糊的一团
答:
具体的自溶原因,不清楚你表达的蛋白有没有毒性,不过IPTG诱导浓度0.1mM应该足够了,
诱导时间10h也没啥必要,一般4-6个小时就够了
。收集菌体时,是否自溶你看不清楚的,洗涤菌体最好用生理盐水洗涤,这样能维持渗透压。
蛋白质表达
一般的条件?
答:
一般影响
表达
的条件是温度,培养基PH值(一般为7.0),
IPTG
浓度,转速等,常用条件37度,OD600为0.5-1.0间,IPTG浓度我常用0.1mmOL/L,也可以高到1.5mmol/L。转速需要自己摸索,不要高于200r/min。不同的载体和基因都不同。并没有完全适用的万能条件。
重组大肠杆菌在
表达蛋白
过程中注意哪几个问题
答:
1
诱导时间IPTG诱导时间
过长会出现包涵体,诱导时间过短会出现
蛋白
产率不高。2.诱导温度;IPTG诱导的适宜温度为25℃~30℃,有利于蛋白产率的提高。3,诱导剂浓度:合适的诱导剂浓度可以提高蛋白产率,浓度过高容易出现包涵体。4.IPTG加入时间:诱导剂过早的加入会对菌生长有抑制作用。一般在对数生长期,即OD...
诱导表达
时
IPTG
加的
时间
太早有影响吗?
答:
如果在菌没有进入对数期,即OD在0.4以下就加
IPTG的
话,对菌的生长有抑制作用.菌浓度过低,
蛋白
的
表达
量也会低,会影响到后期蛋白的检测.所以还是在菌对数期的时候加,即0.6-0.8,比较好
蛋白
原核
表达
答:
我们使用
IPTG
(异丙基硫代半乳糖苷)做为
诱导
剂。在没有乳糖存在时,lac操纵子处于阻遏状态。I序列在PI启动序列操纵下
表达
的Lac阻遏
蛋白
与O序列结合,抑制转录启动。当有乳糖存在时,去阻遏后lac操纵子即可被诱导。注:真正的诱导剂并非乳糖本身,糖进入细胞,经β-半乳糖苷酶催化,转变为异乳糖。异丙基...
iptg
相比较乳糖
诱导
有何优越性
答:
IPTG不被菌体代谢,为乳糖类似物,一旦进入细胞就会产生持续长久的诱导效果,所以
IPTG的诱导
效率高,往往只需要很少量(1mmol/L)即可达到理想诱导效果。由于IPTG不被代谢,在胞内专一诱导外源
蛋白
的
表达
。不受细胞代谢的影响,诱导效果持续稳定。乳糖有双效作用,既能做为诱导剂异乳糖的前体物质,又可以做...
基因原核
表达
的详细过程
答:
重组表达质粒转化大肠杆菌JM109,经1mmlo/L
IPTG
在32℃
诱导表达
2h,裂解细菌,进行PAGE凝胶电泳鉴定融合
蛋白
的表达。【结果】RT-PCR扩增产物分子大小为327bp,序列分析表明为人resistin基因完整编码区。PCR产物与T载体连接、转化大肠杆菌后,从细菌质粒中酶切回收了目的片段。重组表达质粒经EcoRI和KpnI双酶切后能产生出327...
1
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