我比对氨基酸序列，由于保守性及较高，老师让我用核苷酸序列比对。直接用核苷酸序列设计引物，由于核苷酸长度不一,但编码区CDS是差不多。抠出CDS比对，相似性还是比较理想的。CDS是小写的。然后也没对齐。还有数字，跟全长核苷酸序列不一样。我自己整理下格式，前面加个大于号，变成FAST格式。有的软件还不识别。准备手写引物按后用软件打分，哪位朋友有这方面的经验吗？谢谢指导。没分了。。。悲催。求义务帮助。
要设计简并引物是么？
最好还是使用CDS序列来做比对，然后根据保守区设计简并引物，CDS两端的非翻译区在物种间变化太大，不适合设计引物。
把获得各个物种的CDS做成fasta格式的，序列最好处理成纯序列格式的不含其它任何字符。然后用比对软件比对一下，如mega，DNAman或者是vector NTI里的比对工具都可以做比对。
在比对结果里找到非常保守的区域就可以设计简并引物了。
设计的简并引物可以根据经验公式自个算Tm值。不用计较打分的问题。因为你只能在保守区设计引物。
图是做的DNA序列比对，有保守区和不保守区。我觉得，引物的3'端最好位于最保守的区域。
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