在一个老美的实验室打工,做的是病毒DNA在细菌内扩增后的蛋白质提纯。通常是用尿素提纯完以后,应该用什么温度储存更合适?求指点!
蛋白质因为其三级,四级结构复杂,一般不推荐反复冻融,这样可能极大损害蛋白活性。而且在保存时最好加入一点BSA,一般0.1%左右即可。
希望能够帮到你~有问题一起讨论解决哦~追问
谢谢,这个加BSA我之前也听说过,还请问你说的这个有文献支持吗,这样更容易说服老板。另外我们这个纯化蛋白浓度不是很高,不知道会不会对活性有影响。还有一种说法是加甘油,可是洗脱困难,我有点不是很理解这个原理。
谢谢!关于液氮和干冰乙醇速冻有具体的方法吗,最好是有文献支持。
追答这个做生物物理的人都知道。当你研究一个蛋白的“温度--比热容”变化曲线,会发现即使在4度到20度的缓慢变化中,蛋白的热容还是会有改变,反映出来就是熵值会改变,这就表明蛋白的构象会发生变化,从而可能发生变性,失活,蛋白构象不均一等问题。因此速冻是为了让蛋白的构象来不及改变,而保存于-80也会使蛋白基本保持稳定。当然对于做蛋白晶体学的来说,最理想的是用新鲜纯化的蛋白。对于加甘油保持蛋白稳定性的办法在activity assay里无可厚非,记住做对照就行,对于晶体学来说,甘油是cryoprotectant,不利于长晶体。解决洗脱困难,你可以在buffer里加入少量甘油,然后在承接elution的容器中预先加入甘油,这个也是有很多不稳定的酶是这么纯化的,比如TEV,容易aggregate,就是这么处理。
另外,怕4度保存长菌降解的话,可以用0.2um的膜过滤除菌,或者在elute buffer里加sodium azide。但是只能保存较短的时间,平均两三天就是上限了。
你老板为啥这种常识都要文献支持,老板是做生物的不?
先回答这么多,有问题可以追问。
可以解释一下“冻干”吗,刚开始做,跟文盲差不多,谢谢啦!
追答就是将你得到的蛋白溶液分管然后用冻干机进行冻干,冻干简单点儿说就是将溶液状态的蛋白进行抽真空转变成干粉状态,这样更加易于保存。