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原核表达蛋白在沉淀里怎么办
原核蛋白表达
,总是
在沉淀中
,
怎么解决
答:
应该是
原核表达
宿主菌比较准确 原核表达宿主菌之前可以
表达蛋白
,放一段时间不表达蛋白原因很多 首先要确认其他条件是否也有改变,比如其他基因,质粒载体,表达条件等等 原核表达宿主菌保存条件没有控制好可能导致宿主菌退化,被污染等等,结果就造成
蛋白表达
变少或者不表达。
我想要纯化的
蛋白
主要
在沉淀里
高手指点哈
答:
原核表达吧?那麻烦了,
得先拿8M尿素变性,然后2M尿素复性
,具体是有点麻烦,还得看你的蛋白二硫键的多少,这直接影响到复性的效果。反正挺复杂,建议从CNKI里下些原核表达的博士硕士论文看看,这样的写的步骤比较全。
真核
蛋白表达在
细胞超声
沉淀中
该
怎么办
答:
因为
原核
生物缺乏翻译后的修饰,所以表达的真核
蛋白
和真核
中表达
有所差异,可能没有生物学活性等,但是要是做免疫原应该没问题; 基因需为cDNA,不能含有内含子,原核细胞不能对mRNA进行剪切; 要分析DNA序列信息,分析其密码子,由于
原核
与真核。
原核表达
常见问题(三)
蛋白
纯化后续的问题分析
答:
2. 填料选择不对,与蛋白结合力太弱,
更换适合改纯化蛋白质的填料。3. 直接收取目的蛋白,再用其他纯化方法进一步纯化
。1. pH 发生变化,导致蛋白质沉淀。找准蛋白质的一个等电点,溶液环境的ph值不能在蛋白质等电点的附近,如果在等电点的附近的时候,这个时候蛋白非常容易沉淀。可根据软件计算入VEC...
关于
原核表达
问题
答:
菌浓度OD=0.6-1.0开始诱导,你可以在2h,4h,8h的时候取个样,跑一个PAGE胶考马斯染色看看总的目的蛋白浓度,每个
蛋白表达
速度不同,需要的时间不一样,一般4h就可以了,最好还要做一次超声破碎或者酶解,离心分离以后
沉淀
和上清分别煮样,看你的
蛋白在
上清和沉淀当中的分布,最好是在上清,如果没...
在
原核表达
系统中如何分离到有活性
的蛋白质
答:
1,如果
蛋白
是分泌
表达
,直接分离上清(传统的方法:离心去细胞和细胞碎片→过滤(0.45或0.22nm)→蛋白纯化(蛋白纯化是一个很复杂的过程,这里一笔带过了,电泳,层析,
沉淀
等方法)→获得目的蛋白 2,胞内蛋白,首先裂解细胞(这样细胞内的杂蛋白就多了)→离心获上清→沉淀(硫酸铵,出去大部分杂...
原核表达
包涵体复性实例
答:
首先,采用先复性再纯化的方法,复性效果如图所示:泳道1:包涵体溶解后上清泳道2:包涵体溶解后
沉淀
泳道3-7:逐步增强洗脱液浓度(20mM-60mM-100mM-300mM-500mM)另一种复性策略是柱上复性,步骤如下:泳道1:诱导前状态泳道2:诱导后状态泳道3-14:逐步降低尿素浓度(8M-6M-4M-2M-1M-0.5M-0M)...
原核表达
后如何验证
蛋白质
是正确的呢
答:
1,如果
蛋白
是分泌
表达
,直接分离上清(传统的方法:离心去细胞和细胞碎片→过滤(0.45或0.22nm)→蛋白纯化(蛋白纯化是一个很复杂的过程,这里一笔带过了,电泳,层析,
沉淀
等方法)→获得目的蛋白 2,胞内蛋白,首先裂解细胞(这样细胞内的杂蛋白。
在做
原核表达
时带his组氨酸的目的
蛋白怎么
也结合不上镍柱,为什么?_百度...
答:
首先找一种正常的标签蛋白进行一下纯化试验,如果能够纯化出来那就是你的蛋白的问题,可能是
蛋白在表达
的时候非正常折叠,标签被折叠在内部,没有在蛋白表面游离着,这样的话当然不会被镍柱捕获了。比较严重的情况就是包涵体的形成,是否形成包涵体你可以根据蛋白的性质反应或者是电泳检测一下离心后的细胞...
原核表达
系统能用来做免疫共
沉淀
吗
答:
需要制作标签融合
蛋白
,以方便洗脱IgG和beads。具体如下:1.制作含标签(如myc)的目的蛋白克隆载体。2.用含anti-myc的beads,pull-down目的蛋白。3.最后洗的时候,要有一次用myc的peptide洗脱液进行洗脱beads和anti-myc。4.这时上清就只含有你的目的蛋白,而去除了IgG....
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