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IPTG诱导蛋白表达低怎么办
谁能给我解释一下什么叫冷
诱导
,要
怎么
做?
答:
如果是做
蛋白表达
的话,冷诱导应该是指的低温诱导吧?细菌37C生长到一定量,加入
IPTG
进行
诱导表达
,正常情况下应该在30C进行诱导表达。但是为了避免表达速度过快形成大量包涵体,所以选择更低温度进行诱导。可以尝试25C,20C,我们以前实验室还尝试过18C和16C,只是这样培养时间就需要比较长,需要过夜。
IPTG诱导表达
后的
蛋白
上样问题
答:
IPTG诱导
后一般为胞内
表达
。1.检验
蛋白
的表达:取微量菌液,离心收获菌体,然后用PBS 之类重悬,洗涤菌体若干次,加入与菌液等量的PBS,取菌悬液与上样buffer混合,100度3min,取上清上样。对照为未诱导的菌体。2.蛋白的可溶性鉴定:离心取菌体后,用PBS重悬,超声破碎,分离上清和残片,上清直接制...
为什么
用IPTG诱导蛋白
没
表达
?
答:
中间有移码了,但用anti-myc做Western仍能检测到微量的目大小的条带,而将移码缺失补上后,目的条带变强了很多。可能的原因是移码时发生了小比例的 ribosomal frameshift,
表达
出了类似大小的带myc标签的
蛋白
。而你的目的片段如果突变出个终止密码子什么的,也可能表达出微量蛋白的。
诱导蛋白表达
为什么od值到0.4才能加诱导剂
答:
一般是将菌摇到OD600=0.4-0.6,然后加入终浓度1mM的
IPTG
(这个一般不变,诱导不出来再考虑适当多加点,例如2-5mM),但是诱导时间和诱导温度根据
诱导蛋白
大孝性质的不同而不同,需要摸索的,你可以做个预实验,隔两个小时取样,最后SDS-PAGE,寻。
诱导
式
IPTG的
浓度应该好多?要试验确定吗
答:
一、需要做实验确定,
诱导
时
IPTG的
浓度一般情况是1mg/ml,不过有的蛋白有时不需要这么高的浓度。二、可以做一个梯度诱导,一般在菌浓OD600达到0.8-1.0的时候诱导。三、培养两个小时候后,每隔一小时取样,大约在3-5小时的时候
蛋白表达
达到最高值,最后收菌后,加上以前的取得样品跑SDS-PAGE胶检验...
为什么加了
IPTG诱导
重组
蛋白
后细菌的生长速度明显减慢?
答:
有些药物可以抑制细菌的生长,但不见得在
蛋白
层次明显表现出来。你可以尝试从mRNA水平进行考虑或者转录因子角度进行考虑。mRNA水平的,你可以做mRNA
表达
谱芯片来看看你的mRNA表达的情况,相信在
IPTG的
作用下与没有IPTG组对比的mRNA表达是有比较大的差异的。但蛋白的表达就不见得了。
iptg诱导
前后在SDS电泳结果中
怎么
看
答:
加入
IPTG
后有目标
蛋白表达
,正常情况下,两个泳道相比,应该能在
诱导
后的泳道看到有某一个比较明显的蛋白条带的增粗。这个条带的位置可以根据目标蛋白的预计分子量大小来找,当然有时候不是严格与预测分子量一致,会多少有点出入,但是表达成功的话,会有明显不一样的条带的。如果表达量不大,就需要...
诱导表达
时
IPTG
加的时间太早有影响吗?
答:
有影响。加了之后,细菌提前
表达
,很多菌一开始表达自己就会很快死掉的。所以如果你加得太早,
蛋白
的利率就会很少。
用IPTG诱导表达
的时间是否越长越好,为什么?
答:
用IPTG诱导表达
的时间不是越长越好,因为只有在特定的环境信号(加入IPTG)刺激下,目的基因才会被激活,之后才会产生大量的代谢表达产物,收集有较多表达量的菌体。如果不用IPTG的话,大部分目的
蛋白
是不会表达的,有少部分可能会有极少量的表达,称之为泄漏表达。科学研究:IPTG常用于需要诱导β-半乳糖...
IPTG 诱导表达
答:
IPTG诱导表达
原核表达系统将外源基因引入原核细胞,将外源基因引入原核细胞,并使其在原核细胞中高效地表合成基因产物的体系。达、合成基因产物的体系。原核生物基因表达特点原核生物中功能相关的基因串联在一起,形成操纵子。形成操纵子。操纵子(操纵子(operon)是一组功能上相关,)是一组功能上相关,...
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