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原核表达诱导出两个条带
原核表达
蛋白质的时候
出现
了
两条带
,是什么原因呢
答:
是不是形成二聚体了?或目的蛋白内部有某个酶的位点,被水解掉一段
原核表达出来
的蛋白纯化后怎么是三
条带
答:
可能是蛋白发生了降解
,在表达后期、纯化前期需要加入蛋白酶抑制剂。
原核表达
产物纯化后有一条非目的蛋白
条带
,怎么办
答:
如果是杂带,优先考虑优化你使用的纯化方案,如Ni柱,考虑延长washing buffer的时间和提高咪唑浓度,使用分辨率更好的填料;还去不掉,考虑用2步或3步纯化,比如用离子交换、凝胶过滤。个人见解,仅供参考,祝一切愉快!
关于
原核表达
问题
答:
菌浓度OD=0.6-1.0开始
诱导
,你可以在2h,4h,8h的时候取个样,跑一个PAGE胶考马斯染色看看总的目的蛋白浓度,每个蛋白
表达
速度不同,需要的时间不一样,一般4h就可以了,最好还要做一次超声破碎或者酶解,离心分离以后沉淀和上清分别煮样,看你的蛋白在上清和沉淀当中的分布,最好是在上清,如果没...
在做大肠杆菌
原核表达
,验证有目的
条带
,但是大剂量
诱导
并破碎离心后电...
答:
你这好像不是拖尾,是破碎使得蛋白质破断了,我们这边也有人超声波裂解细胞裂断了,差不多就是这个样子,你最好摸索一个比较好的破碎时间
原核表达
时跑完电泳,
条带
应该是多大,是和自己的目的基因蛋白的分子量一...
答:
原核表达
的蛋白是没有修饰作用的,一般而言电泳表观分子量应该与蛋白分子量+标签的大小一致。但有时候会有一定的迁移,比如用pet28a表达的蛋白进行电泳时表观分子量会比蛋白分子量+标签大5kD左右。不过通过对比未
诱导
的阴性对照能很清楚地看出来自己表达的蛋白。
为什么在做
原核表达
SDS-PAGE时对照的还要做个加
诱导
剂的呢,那诱导剂...
答:
因为你做的并不是纯化的蛋白电泳,而是菌体的总蛋白,如果不作对照的话,就不能说明哪个
条带
是你的目的基因的特异
表达
。如果做目的基因不加
诱导
剂的对照的话,可以看出目的基因在不诱导下的本底表达水平。也可以看出诱导剂的作用。我们实验室就是那么做的,有时候还会加空菌(宿主菌)的对照。
问个问题哦,我进行的是
原核
蛋白
表达
,表达载体是PET32a,表达菌液超声...
答:
首先得判断蛋白
条带
是否正确,因为32a表达过程中,会在目标蛋白上加上部分自己序列,所以电泳图谱中你所要表达的蛋白,应该比你自己预期的大20-30kDa。其次,
原核表达
,只是表达了酶蛋白序列,但蛋白序列与酶之间不能划等号,要有一个正确的加工之后形成合适的二、三级结构,蛋白才有活性 ...
原核表达
常见问题(三)蛋白纯化后续的问题分析
答:
1.目的蛋白纯化浓缩之后,目的蛋白
条带
周围出现杂带,据推测可能是插入目的基因后,外源基因的
表达
刺激大肠杆菌产生了宿主蛋白酶,对异源蛋白进行降解的产物。样品缓冲液有相同的 pH 和离子强度。离子交换纯化是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不一样达到分离目的的一种蛋白纯化...
DNA与蛋白质相互作用的研究方法有哪些
答:
a、同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列,经六氢吡啶切割之后,电泳分离呈现
两条带
,有一个空白区 b、不同转录因子蛋白质结合的靶DNA序列,经六氢吡啶切割后,电泳分离呈现三条带,没有空白区域的出现。4、应用: a、甲基化干扰实验可以用来研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系; b、是足迹实验的一种有效的补充...
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