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IPTG诱导蛋白表达
我用BL21(DE3)菌株
表达
一外源基因,用
IPTG诱导
,为什么我不加IPTG的对照...
答:
有两种可能,一种是大肠杆菌里本身有这么大小的
蛋白
,不过这个可能性太小。另外一个是叫做本底
表达
,就是你导入后目的蛋白在未
诱导
情况下也会表达,这可能是大肠杆菌产生了类似
IPTG
的物质,这个在原核表达中是很常见的,如果本底表达量不大的话对实验结果没什么影响的。
诱导表达
时
IPTG
加的时间太早有影响吗?
答:
有影响。加了之后,细菌提前
表达
,很多菌一开始表达自己就会很快死掉的。所以如果你加得太早,
蛋白
的利率就会很少。
诱导
式
IPTG
的浓度应该好多?要试验确定吗
答:
一、需要做实验确定,
诱导
时
IPTG
的浓度一般情况是1mg/ml,不过有的蛋白有时不需要这么高的浓度。二、可以做一个梯度诱导,一般在菌浓OD600达到0.8-1.0的时候诱导。三、培养两个小时候后,每隔一小时取样,大约在3-5小时的时候
蛋白表达
达到最高值,最后收菌后,加上以前的取得样品跑SDS-PAGE胶检验...
包涵体纯化
蛋白
复性案例分析——钟鼎生物
答:
蛋白表达鉴定结果分析
IPTG诱导蛋白表达
,经12% SDS-PAGE分析,目标蛋白主要存在于沉淀中,结果如图所示 图1 蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析 Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression M: 蛋白质分子质量标准 1: 未诱导 2: 诱导后 3: 诱导破碎后上清 4: 诱导破碎后沉淀 包涵体蛋白的变复性 1. 将菌体...
诱导蛋白表达
为什么od值到0.4才能加诱导剂
答:
一般是将菌摇到OD600=0.4-0.6,然后加入终浓度1mM的
IPTG
(这个一般不变,诱导不出来再考虑适当多加点,例如2-5mM),但是诱导时间和诱导温度根据
诱导蛋白
大孝性质的不同而不同,需要摸索的,你可以做个预实验,隔两个小时取样,最后SDS-PAGE,寻。
蛋白
原核
表达
答:
乳糖操纵子模型主要有负调控和正调控,这里主要用的是负调控的机制。我们使用
IPTG
(异丙基硫代半乳糖苷)做为
诱导
剂。在没有乳糖存在时,lac操纵子处于阻遏状态。I序列在PI启动序列操纵下
表达
的Lac阻遏
蛋白
与O序列结合,抑制转录启动。当有乳糖存在时,去阻遏后lac操纵子即可被诱导。注:真正的诱导剂并非...
原核
表达
发现在37℃
诱导
不出来原核表达测序回来如何判断
蛋白
译码
答:
在原核
蛋白表达
体系中,如E.coli(大肠杆菌表达系统),外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达,本文详细讲述了常用诱导剂
IPTG 诱导
原理,对外源
蛋白诱导
表达原理以及实验步骤。原核生物绝大多数的基因按功能相关性成簇地排列,且密集于染色体上,共同形成一个转录单位——操纵子,也称基因表达的协同单位。
蛋白表达
实验的整个流程是什么?
答:
诱导表达
:通过添加合适的诱导剂,如异丙基β-D-硫代半乳糖苷
IPTG
,诱导目标基因的表达。注意选择适当的诱导时间和诱导条件,以确保最佳的表达水平。细胞收获:在诱导期结束后,收获表达细胞。对于真核细胞,通常需要先裂解细胞膜来释放目标
蛋白
。而对于细菌细胞,可以通过离心或超声等方法裂解细胞壁。蛋白...
GST pull-down实验步骤+
蛋白
纯化
答:
首先,诱导 GST-β-TrCP 的表达:将保存的100 mL感受态细胞解冻并均匀悬浮。将重组质粒导入BL21 (DE3) 细菌,轻轻混匀后在42℃热激并立即冰镇。接种于预热的Amp/LB培养基,37℃培养45 min后,涂布在平板上培养过夜。挑取单克隆菌株培养,并扩增至对数中期。加入
IPTG诱导蛋白表达
,37℃振荡培养2-4小时...
扩培时直接加入了
IPTG
会怎么样
答:
IPTG
之所以在
诱导
阶段加入,目的在于尽量减少大量
表达蛋白
(通常需要表达的蛋白也是工程菌所不需要的)对菌体生长的影响,便于较早达到所需菌体浓度,利于诱导阶段大量表达蛋白。题主提到的这个问题,一般来说可能会对菌体的生长速度产生影响,某些较敏感的蛋白有可能会形成包涵体,或是浓度有所变化,但是表达...
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