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蛋白纯化后仍然不纯怎么办
为什么
蛋白纯不
出来?
答:
最好是先做粗纯化
,比如分级盐析沉淀一下 然后用疏水层析 浓缩样品再用
离子交换
精细纯化 还有一种就是
试着在构建阶段给蛋白加一段tag
,比如组氨酸的标签 这样可以
用亲和层析做破碎液纯化效果会好很多
我也是做
蛋白纯化
的,有种蛋白第一次纯化时,也是非常杂,你之前又遇到过...
答:
(所以,
第一次用连续梯度洗脱,观察最佳洗脱的咪唑浓度是很有必要的
);如果一种方法(如亲和)经过优化,某些杂蛋白可能就是难以分离,仍不足以得到理想的纯度,完全可以采用第二步纯化,如
离子交换
,往往会达到事半功倍的效果,比你总折腾一种方法划算。个人见解,欢迎继续讨论,祝实验顺利!
我
纯化
的
蛋白
总是有沉淀,该
怎么办
已经改过盐浓度,沉淀
还是
在啊_百度...
答:
1. 蛋白本身容易絮凝,如果是这样,
可添加Tween-20减少具体产生
。2.pH靠近蛋白的等电点,可根据软件计算入VECTOR NTI计算其理论等电点,尽量纯化的溶剂在远离等电点。3.蛋白浓度过大,调节纯化时蛋白的浓度即可,如果需要高浓度蛋白,
用超滤或冷冻干燥浓缩即可
。4. 离子强度,你已经试过了,这个不说了...
Ni-NTA
纯化
问题,获得不了纯的目的
蛋白
!
答:
2,如果重新构建不可行,对于你的先行体系,
建议如下:适当延长诱导表达时间,以增加目的蛋白含量
;在用咪唑梯度洗之前,先过3-5倍柱体积的buffer,先洗掉一部分杂蛋白,填料要保证已处理充分,既没有上次剩余的蛋白也有足够ni;不要用这么多的梯度,有一点你需要明白,根据你现在的结果来看,60mM的咪唑...
我问师兄如何让
蛋白
纯度更高,他只告诉我这点……
答:
2.抗体纯化
不
简单 将重组抗体片段表达出来
之后
,必须将此片段纯化出来,当时多以亲和层析法搭配目标抗体的抗血清(antiserum)进行
蛋白纯化
,但这一方法常常受到限制:在研究一个未知目标蛋白时,常出现没有抗血清或是相容抗体的情况,这严重影响了实验进度。为此,科学家尝试找出更有效的一步纯化法。 首先,他们考虑在重组蛋...
原核表达常见问题(三)
蛋白纯化
后续的问题分析
答:
盐析沉淀通常对
蛋白质
的高级结构没有破坏,再溶时活性可以完全恢复。常见的例子就是硫酸铵沉淀
纯化
IgG。同样,硫酸铵沉淀也常碰到不可逆的情况。例如大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组蛋白往往在硫酸铵沉淀后再溶困难。3.在Ni纯化的过程中,有一部分镍离子会脱落,脱落的镍离子属于重金属,会对蛋白的...
使用分子筛
纯化蛋白后
发现收率较低,是什么原因
答:
1.
蛋白
可能被蛋白酶降解。可以在样品和缓冲液中加入蛋白酶抑制剂,阻止蛋白酶降解作用 2.样品制备过程中可能吸附在滤器上,更换吸附性更低的滤器材质 3.样品沉淀,可能由于盐或不合适的缓冲液条件引起 4.疏水蛋白,可以酌情采用去污剂、降低极性的试剂和去污剂 5.非特异性吸附,可以通过降低盐离子浓度最...
蛋白纯化
问题
答:
可能是表达的问题。在表达你目的
蛋白
的同时有很多杂蛋白被同时表达了。你可以增加前面洗脱的步骤,尽可能多的将杂蛋白洗脱掉。
...如原核表达
纯化
,
蛋白
总是包涵体该
怎么办
?请大神帮忙解答啊,,_百度...
答:
原核蛋白表达
纯化
是很容易形成包涵体的,在现阶段可以采用俩种手段,一是预防,二是复性。先说“预防”,预防就是指在蛋白过表达形成包涵体前,对表达环境进行优化的一些手段,来降低重组蛋白合成的速率。例如:密码子优化,表达温度的选择,与分子伴侣或折叠酶共表达等等;而
蛋白质
的复性则是指:在变性...
如何提高
纯化蛋白
浓度
答:
蛋白纯化后
浓度太低
怎么办
提高sds-page的上样量 将蛋白样品超滤浓缩几倍提高浓度 wb压片时间稍微延长一点
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